聚乙二醇修飾血紅蛋白制備紅細(xì)胞代用品的研究.pdf

1、本研究以無(wú)基質(zhì)血紅蛋白(Hb)的化學(xué)修飾作為紅細(xì)胞代用品的研究途徑，以聚乙二醇(PEG)修飾Hb作為研究模式，旨在解決Hb偶聯(lián)相關(guān)問(wèn)題。內(nèi)容包括：以生物信息學(xué)和量子化學(xué)的方法確定血紅蛋白的修飾方式與修飾部位，以生物化學(xué)方法完成血紅蛋白的分離純化及修飾產(chǎn)物的制備，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行相關(guān)修飾產(chǎn)物的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功效的研究。 用結(jié)構(gòu)分析和分子模擬方法對(duì)牛與豬血紅蛋白(bHb/pHb)的結(jié)構(gòu)與表面性質(zhì)進(jìn)行了分析，并模擬了聚乙二醇(P

2、EG)通過(guò)選擇性連接物與血紅蛋白偶聯(lián)后對(duì)其結(jié)構(gòu)及攜氧功能的影響。結(jié)果表明，bHb與pHb二聚體中分別有12個(gè)和13個(gè)賴氨酸殘基的氨基具有較高反應(yīng)活性，可以作為進(jìn)行修飾部位，與5KD的PEG-Linker形成的共軛物將大于64KD，但不影響血紅蛋白的攜氧功能。 確立了一個(gè)簡(jiǎn)便的血紅蛋白純化方法及其純度檢測(cè)方法，完成了牛、豬、人血紅蛋白的分離純化。電泳結(jié)果表明，純化產(chǎn)物以32KD的二聚體形式存在，其均一性較高。純度檢測(cè)結(jié)果表明，純化

3、產(chǎn)物中未見明顯磷脂與核酸，其紅細(xì)胞標(biāo)志酶的活性亦低于人血清。拉曼光譜和全波長(zhǎng)掃描證實(shí)Hb純化產(chǎn)物空間結(jié)構(gòu)與標(biāo)準(zhǔn)Hb相似，攜氧功能未受影響。 以一定比例的血紅蛋白純化產(chǎn)物與PEG(5000)-Linker組成反應(yīng)體系，在特定條件下完成偶聯(lián)反應(yīng)。電泳和三硝基苯磺酸顯色結(jié)果表明，相當(dāng)數(shù)量的PEG分子能與血紅蛋白二聚體特異偶聯(lián)，且60％以上偶聯(lián)產(chǎn)物大于64KD。以全波長(zhǎng)掃描方法分析血紅蛋白的光譜特性，發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)產(chǎn)物波形改變。確立了PEG-