基于脂質(zhì)體-多肽材料的基因-藥物載體系統(tǒng)的構(gòu)建與評價.pdf

1、腫瘤的化學(xué)療法是目前腫瘤治療最常用的方法之一，但化療藥物對腫瘤組織的選擇性不高，毒副作用大。目前的研究中研究者傾向于將藥物包封于合適的載體系統(tǒng)中，使藥物在病灶部位選擇性釋放，這樣不僅能有效地提高藥物的生物利用率，還能降低藥物的毒副作用和用藥劑量。腫瘤的基因療法，是引入外源有治療作用的基因到病人病灶部位的一種新型療法，安全高效的基因?qū)胂到y(tǒng)是基因療法能否成功的保障。因此，理想的載體系統(tǒng)是實現(xiàn)化學(xué)療法和基因療法高效安全的關(guān)鍵所在。本文以脂質(zhì)

2、體和多肽作為載體材料，設(shè)計合成了 pH敏感型的載藥脂質(zhì)體和新型載基因多肽復(fù)合物。
　　本研究分為三個部分：第一部分：設(shè)計了一種咪唑基修飾的pH-敏感材料一＃-(3-氨基丙基)咪唑-膽固醇(IM-Chol)，通過薄膜分散法制備了 p H敏感型的IM-Chol脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)，通過正交試驗來尋找脂質(zhì)體制備的最優(yōu)條件，研究了該脂質(zhì)體在不同pH條件下的形態(tài)、電荷和體外釋藥的區(qū)別，并用 MTT法來評價該類材料的安全性。透射電鏡結(jié)果表明IM-C

3、hol脂質(zhì)體在中性條件下可以形成均勻的球體，但是當(dāng)p H值下降到5.0時，IM-Chol脂質(zhì)體的均勻的球形結(jié)構(gòu)被破壞。在中性和酸性條件下IM-Chol脂質(zhì)體的電位分別為為-15.1 m v和7.4 m v。以姜黃素為模型藥物，我們制備了載藥的IM-Chol脂質(zhì)體。體外釋藥的結(jié)果顯示，在中性條件下，姜黃素24 h內(nèi)的累計釋放率為35.25％。在 pH5.0的條件下，24 h內(nèi)的累計釋放率可以達(dá)到72.5%，且呈現(xiàn)突釋現(xiàn)象。結(jié)合透射電鏡、z

4、eta-電位和體外釋藥的結(jié)果，可以證實IM-Chol脂質(zhì)體具有明顯的p H敏感特點(diǎn)。裸藥姜黃素和姜黃素IM-Chol脂質(zhì)體對腫瘤細(xì)胞的抑制效果可以看出脂質(zhì)體的確能夠提高姜黃素的腫瘤殺傷作用。鑒于腫瘤部位p H值低于正常組織的特點(diǎn)，IM-Chol脂質(zhì)體可以用于腫瘤藥物的靶向治療。第二部分：設(shè)計并合成了三條陽離子多肽KKTNVTLSKKRKRR(Pepl)、CigKKTNVTLSKKRKRR( Pep2)和 RRKRKKK( C18) KK

5、RKRR( Pep3)，研究對比了它們在基因傳遞方面的性質(zhì)。與未經(jīng)疏水烷基鏈修飾的多肽（Pepl)相比，Pep2和 Pep3可以在較低的復(fù)合比下與D N A有效復(fù)合。瓊脂糖凝膠電泳顯示Pep2、Pep3在N/P比2時能夠有效阻滯DNA的迀移，而 Pepl在 N/P比4時能夠有效阻滯D N A的泳動。Pep2、Pep3在N/P比為2的情況下與DNA的復(fù)合物顯示正電性。透射電鏡（TEM)結(jié)果證明三條多肽都能夠與DNA復(fù)合形成穩(wěn)定的球形復(fù)合物

6、。此外，通過MTT實驗檢驗三條多肽的安全性，結(jié)果表明EC109和293T細(xì)胞系在最大濃度500 m g/L的作用下，相對存活率均在75%以上，說明其生物相容性良好。體外基因轉(zhuǎn)染實驗表明，與多肽P e p l相比， Pep2和 Pep3可介導(dǎo)更為高效的基因表達(dá)水平。Pep3與Pep2相比，雖然正電荷增加，但轉(zhuǎn)染效率并未升高，進(jìn)一步通過圓二色譜觀察多肽水溶液的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Pep2形成的是a-螺旋，而 Pep3形成的是無規(guī)卷曲。研究者通過圓

7、二色譜分析發(fā)現(xiàn)眾多穿膜肽皆具有a-螺旋的空間構(gòu)象。因此推測Pep2轉(zhuǎn)染效率高的原因可能是Pep2的a-螺旋的空間構(gòu)象促進(jìn)了穿膜能力。第三部分：選擇功能化的SH-PEG-COOH作為連接物，將第二部分中的三條多肽鏈 KKTNVTLSKKRKRR( P e p l)、CigKKTNVTLSKKRKRR(Pep2)、RRKRKKK(C18) KKRKRR(Pep3)與金納米通過金硫鍵和酰胺鍵共價連接，得到多肽-金納米類的載體系統(tǒng)AuNPs-P

8、EG-Pepl、AuNPs-PEG-Pep2、AuNPs-PEG-Pep3,以期獲得具有更高轉(zhuǎn)染效率的載體系統(tǒng)。透射電鏡檢測結(jié)果表明所制備的多肽-金納米顆粒的粒徑在30nm左右，分布均勻，形狀規(guī)則；與 DNA復(fù)合后的粒子粒徑有所增大，約40nm。Zeta電位和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，AuNPs-PEG-Pep2、AuNPs-PEG-Pep3在復(fù)合比為1時顯示正電性，能夠有效復(fù)合DNA，而AuNPs-PEG-Pepl在復(fù)合比2時有效復(fù)合D