聚精氨酸修飾的酸敏感脂質(zhì)體的構(gòu)建和評(píng)價(jià).pdf

1、目的:
　　腫瘤靶向制劑已成為近幾年治療癌癥的研究熱點(diǎn)，此種制劑可以將藥物盡可能多的輸送到靶組織，進(jìn)而發(fā)揮藥物的治療作用。脂質(zhì)體具有類似生物膜的結(jié)構(gòu)，作為納米給藥制劑的一種非病毒載體，因其具有低的免疫原性、低毒性以及靶向性等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛作為腫瘤靶向制劑的重要載體。但是，脂質(zhì)體仍然存在體內(nèi)易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除、穩(wěn)定性差、攝取效率低等問(wèn)題，因此，設(shè)計(jì)一種修飾后的改良脂質(zhì)體對(duì)生物大分子有效輸送到靶器官具有重要意義。
　　本研究構(gòu)建

2、了三種具有不同功能性脂材的PEG化脂質(zhì)體:普通載藥脂質(zhì)體NL、CPP修飾載藥脂質(zhì)體CL和含腙鍵CPP修飾載藥脂質(zhì)體CHL。并對(duì)三種脂質(zhì)體進(jìn)行電位和粒徑的表征，以MCF-7和A549細(xì)胞為模型細(xì)胞，對(duì)不同脂質(zhì)體與細(xì)胞作用特點(diǎn)進(jìn)行考察。
　　方法:
　　1、琥珀酰亞胺基-對(duì)甲?；郊姿峒柞?SFB)和3-馬來(lái)酰亞胺基丙酸酰肼(MPH)分別制備儲(chǔ)備液，充氮?dú)?，室溫?cái)嚢瑁魮]去有機(jī)溶劑，得干燥的黃色固體S-M。
　　2、自制

3、的S-M與DSPE-PEG-NH2分別溶解，室溫充氮?dú)鈹嚢瑁弥虚g體DSPE-PEG-Hz。
　　3、取CPP樣品管，室溫平衡30min溶解，加入到DSPE-PEG-Hz溶液中，充氮?dú)?，室溫避光反?yīng)48h，旋蒸揮干有機(jī)溶劑，得黃色目標(biāo)產(chǎn)物DSPE-PEG-Hz-CPP。
　　4、構(gòu)建普通載藥脂質(zhì)體NL、CPP修飾載藥脂質(zhì)體CL和含腙鍵CPP修飾載藥脂質(zhì)體CHL，并用馬爾文粒度儀進(jìn)行粒徑和電位的表征。
　　操作方法如下:

4、
　　分別以SPC/DC-chol/Chol/DSPE-PEG、SPC/DC-chol/Chol/DSPE-PEG/DSPE-PEG-CPP、SPC/DC-chol/Chol/DSPE-PEG/DSPE-PEG-Hz-CPP為脂材旋轉(zhuǎn)成膜，加DEPC水（含siRNA3.75nmol），手搖水化脫膜，水浴超聲，得半透明體系NL、CL、CHL。
　　5、用流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡分析經(jīng)NL、CL、CHL處理的MCF-7和A5

5、49細(xì)胞，流式分析以胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度考察指標(biāo)，評(píng)價(jià)細(xì)胞攝取效率。激光共聚焦顯微鏡清楚地顯示了三種制劑輸送siRNA至細(xì)胞中的位置。
　　6、用激光共聚焦顯微鏡分析經(jīng)CL、CHL處理的A549細(xì)胞，觀察siRNA是否從內(nèi)涵體中逃逸，發(fā)揮基因沉默效應(yīng)。
　　結(jié)果:
　　1、合成S-M:黃色固體粉末，質(zhì)譜圖中m/z=413.36，與S-M理論計(jì)算值413.36(M+H+)相符，證明產(chǎn)物結(jié)構(gòu)正確。
　　2、合成DSPE-

6、PEG-Hz:中間體平均離子峰為3103.41，與理論設(shè)計(jì)肽平均分子量相符，證明產(chǎn)物中有目標(biāo)中間體。
　　3、合成DSPE-PEG-Hz-CPP:產(chǎn)物平均分子離子峰為4611.08，與理論設(shè)計(jì)肽平均分子量相符，證明合成了目標(biāo)產(chǎn)物。但是質(zhì)譜圖中可看到一個(gè)平均分子量為2832.19的雜峰，為第二步的原料DSPE-PEG-NH2，產(chǎn)物合成的方法以及純化的步驟還需改進(jìn)。
　　4、載藥普通脂質(zhì)體NL、CPP修飾載藥脂質(zhì)體CL和含腙鍵C

7、PP修飾載藥脂質(zhì)體CHL粒徑和電位測(cè)得結(jié)果如下:
　　NL、CL、CHL的平均粒徑分別為124.9nm、145.6nm、156.1nm，分散指數(shù)(PDI)平均值分別為0.302、0.246、0.284，制得的脂質(zhì)體粒徑均符合要求，且粒徑分布集中，體系均趨于穩(wěn)定。
　　5、用流式細(xì)胞儀和激光共聚焦分析經(jīng)三組制劑處理的細(xì)胞
　　相比陰性對(duì)照組，普通載藥制劑NL處理的細(xì)胞胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度有很大的提高，表明DSPE-PEG修飾

8、的PEG化脂質(zhì)體提高了細(xì)胞攝取效率。
　　CPP修飾載藥脂質(zhì)體CL和含腙鍵CPP修飾載藥脂質(zhì)體CHL處理的細(xì)胞胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度相比NL大幅提高，表明CPP修飾的載藥PEG化脂質(zhì)體能進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞的攝取效率。
　　激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，三種制劑均成功地將siRNA輸送到細(xì)胞質(zhì)中，經(jīng)CPP修飾的脂質(zhì)體CL、CHL輸送siRNA至細(xì)胞質(zhì)中的數(shù)目（綠色熒光）相比普通脂質(zhì)體NL明顯增多，與流式分析結(jié)果相對(duì)應(yīng)。
　　6、用激光

9、共聚焦顯微鏡分析經(jīng)CL、CHL制劑處理的A549細(xì)胞
　　兩組制劑均成功將siRNA輸送到細(xì)胞質(zhì)中，且隨著制劑作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞質(zhì)中siRNA的數(shù)目越多，表明經(jīng)CPP修飾的脂質(zhì)體有效地促進(jìn)了siRNA的胞內(nèi)逃逸。
　　結(jié)論:
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DSPE-PEG-Hz-CPP的合成路線簡(jiǎn)單，合成過(guò)程中未用高毒性試劑，方法重現(xiàn)性好。
　　成功地制備了含腙鍵的CPP修飾的載藥脂質(zhì)體CHL，并與普通脂質(zhì)體NL和CPP修