fMLP修飾膽固醇構(gòu)建的脂質(zhì)體炎癥病灶傳遞系統(tǒng)的研究.pdf

1、炎癥是臨床上普遍存在而又非常重要的病理過程，過度的炎癥反應(yīng)對機(jī)體是非常有害的。臨床上目前使用的抗炎藥物主要為甾體類或非甾體類抗炎藥，但這類藥物均存在作用短暫、易反跳，長期應(yīng)用有肝腎等毒副作用。因此，構(gòu)建新的藥物傳遞系統(tǒng)，使藥物在炎癥病灶選擇性濃集，在增強(qiáng)藥效的同時減少毒副作用，是藥物研究領(lǐng)域需要解決的重要問題之一。
　　七葉皂苷鈉是從中藥娑羅子干燥成熟果實中提取的三萜皂苷鈉鹽，具有明顯的抗炎消腫活性。注射用七葉皂苷鈉目前已在臨床上

2、廣泛用于各種疾病的的抗炎消腫，但其靜脈給藥對血管刺激性強(qiáng)，靜注可引起注射部位疼痛，長時間用藥可能引起靜脈炎。這些弊端極大地限制了其血管內(nèi)給藥的治療，即限制了其在腦水腫、肺水腫等深部器官炎性疾病中的運(yùn)用。更為重要的是，注射用七葉皂苷鈉靜注后會發(fā)揮全身作用，病灶部位特異性差。因此，開發(fā)出一種新的療效好，順應(yīng)性強(qiáng)的七葉皂苷鈉制劑成為患者及醫(yī)務(wù)工作者的迫切要求。近年來，靶向給藥系統(tǒng)因其安全性及順應(yīng)性好，療效顯著等優(yōu)勢，成為醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。N

3、-甲酰-L-甲硫氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酸三肽(fMLP)是最早發(fā)現(xiàn)的白細(xì)胞趨化性肽，最新研究提出fMP具有強(qiáng)大的白細(xì)胞趨化活性，它通過與靶細(xì)胞表面的甲酰肽受體(FPR)結(jié)合可高效激活吞噬細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體的趨化反應(yīng)、細(xì)胞脫顆粒以及失敏反應(yīng)等，對機(jī)體的炎癥反應(yīng)和天然免疫起著重要作用?；谘装Y時白細(xì)胞增多的特點(diǎn)，本文在脂質(zhì)體成分之一的膽固醇上共價修飾fMLP，構(gòu)建了fMLP修飾的脂質(zhì)體，并對所構(gòu)建的脂質(zhì)體向炎癥病灶的傳遞能力進(jìn)行了體內(nèi)外的

4、評價，同時對fMLP修飾脂質(zhì)體的入胞機(jī)制進(jìn)行了初步的探索，為增強(qiáng)炎癥病灶傳遞提供了新的策略。
　　本文第一部分設(shè)計并構(gòu)建了白細(xì)胞趨化性肽fMLP修飾的脂質(zhì)體，擬用于提高脂質(zhì)體向炎癥病灶的傳遞能力。本文將fMLP以NH2-PEG2000-Mal作為橋聯(lián)與脂質(zhì)體材料之一的膽固醇共價結(jié)合，并采用工藝穩(wěn)定，操作簡單的薄膜分散法制備fMLP修飾的脂質(zhì)體(fMLP-LIP)。綜合脂質(zhì)體對細(xì)胞的親和力、血清穩(wěn)定性等因素，確定fMLP的用量占脂質(zhì)

5、體總脂質(zhì)摩爾數(shù)的3％，保護(hù)性聚乙二醇(PEG)占2％。以所篩選出的制備工藝及處方制備的fMLP-LIP粒徑在200nm以下。
　　第二部分制備了香豆素-6標(biāo)記的fMLP修飾的脂質(zhì)體(fMLP-LIP)以及兩組對照組:普通脂質(zhì)體(LIP)和長循環(huán)脂質(zhì)體(LLIP)，各組脂質(zhì)體粒徑均小于200nm。通過對三種不同脂質(zhì)體在血清中的穩(wěn)定性考察發(fā)現(xiàn)，不含PEG的LIP組在血清中較不穩(wěn)定，與含血清的磷酸鹽緩沖液(PBS)混合后透光率降低較為明

6、顯;而其他兩組脂質(zhì)體沒有顯著的變化。為了更為直觀地評價各組脂質(zhì)體向炎癥病灶的傳遞能力，本章對香豆素-6標(biāo)記的脂質(zhì)體進(jìn)行了體外細(xì)胞攝取的考察。巨噬細(xì)胞表面已被證明表達(dá)有甲酰肽的受體，是體外研究甲酰肽的極好模型。但由于巨噬細(xì)胞屬于不繁殖細(xì)胞，本文用0.1μg/ml的佛波醇酯(PMA)刺激分化U937細(xì)胞為巨噬樣細(xì)胞作為體外研究對象，考察了細(xì)胞對各組脂質(zhì)體的攝取能力。結(jié)果表明，分化后的U937細(xì)胞對fMLP-LIP的攝取明顯高于LIP和LLI

7、P組。同時進(jìn)一步通過分化后的U937細(xì)胞對fMLP-LIP在低溫條件下的攝取顯著降低(P＜0.01)，表明其入胞過程依賴于能量。游離的fMLP對其細(xì)胞攝取也表現(xiàn)出了顯著性的抑制，其是否通過受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)還需要進(jìn)一步驗證。
　　第三部分主要對fMLP-LIP向炎癥病灶的傳遞能力進(jìn)行了體內(nèi)評價。本部分選用近紅外染料DIR作為熒光探針標(biāo)記脂質(zhì)體，對不同脂質(zhì)體向炎癥病灶的傳遞能力進(jìn)行定性的體內(nèi)評價。通過小鼠活體及離體組織熒光成像可以觀察到

8、，fMLP的引入大大增加了脂質(zhì)體在炎癥病灶的蓄積。同時，fMLP-LIP在肝、脾、腎等臟器也有一定的分布。結(jié)果表明，與對照組相比，fMLP的引入能夠增加脂質(zhì)體向炎癥病灶的傳遞，但并沒有減少其在肝、腎等臟器的分布。
　　第四部分將已經(jīng)構(gòu)建的fMLP-LIP用于抗炎藥物β-七葉皂苷鈉的藥效學(xué)評價。本部分首先對載β-七葉皂苷鈉脂質(zhì)體的處方及制備工藝進(jìn)行考察，確定載β-七葉皂苷鈉脂質(zhì)體的制備采用薄膜分散—超聲法，固定膽固醇與磷脂的比例為1

9、∶2（摩爾比），藥質(zhì)比為1∶3（質(zhì)量比），載β-七葉皂苷鈉脂質(zhì)體包封率均大于80％，粒徑均勻，且小于200nm。接著考察了三種載β-七葉皂苷鈉脂質(zhì)體對小鼠表面急性炎癥及深部器官炎癥的治療效果?？疾炝似鋵Χ妆街滦∈蠖[脹的抑制作用，對二甲苯致小鼠毛細(xì)血管通透性增加的拮抗作用以及對油酸致小鼠肺水腫的抑制作用。結(jié)果表明，fMLP修飾的載β-七葉皂苷鈉脂質(zhì)體對小鼠耳腫脹，毛細(xì)血管通透性增加以及肺重系數(shù)增加的拮抗作用均更為明顯。
　　第五