膽固醇-半乳糖苷配體修飾紫杉醇脂質(zhì)體的制備及其抑制HepG2腫瘤細胞的研究.pdf

1、目的:
　　半乳糖受體是一種廣泛分布在哺乳動物肝實質(zhì)細胞的受體，又被稱為去唾液酸糖蛋白受體(Asialoglycoprotein receptor, ASGPR)，能夠應用于構建肝細胞特異性靶向脂質(zhì)體。紫杉醇(Paclitaxel，PTX)是紅豆杉中提取的四環(huán)二萜類化合物，是一種廣譜抗癌藥物;臨床研究表明對肝癌細胞的殺傷能力可與氟尿嘧啶相當而副作用較小。探究紫杉醇納米制劑對肝癌的治療是目前紫杉醇研究開發(fā)的新目標。本首先酶促合成膽固

2、醇-半乳糖苷，將其作為配體制備膽固醇-半乳糖苷修飾紫杉醇配體脂質(zhì)體，利用半乳糖配體的肝靶向性，使修飾物在肝臟富集，更有效地發(fā)揮紫杉醇抗肝癌的作用;同時，考察該配體脂質(zhì)體的處方、制備工藝、基本理化性質(zhì)和穩(wěn)定性，并且以紫杉醇注射液和普通紫杉醇脂質(zhì)體為參比制劑，對該配體脂質(zhì)體的體內(nèi)藥物動力學、組織分布、體外的抑制腫瘤細胞活性進行深入探討，為紫杉醇開發(fā)成抗肝癌新型靶向制劑提供理論支撐。
　　方法:
　　1.膽固醇-半乳糖苷的酶促合成

3、、分離純化、結(jié)構表征及穩(wěn)定性考察
　　以吡啶∶丙酮(2∶1，v/v)混合溶劑作為溶媒，利用Novozym435固定化脂肪酶的催化，在一定溫度下，乳糖醇與膽固醇癸二酸二乙烯單酯酯化生成膽固醇-半乳糖苷配體。采用單因素考察分析各因素對該酶促酯化反應的影響規(guī)律，Box-Behnken效應面法設計進一步優(yōu)化工藝參數(shù)。通過層析柱分離純化產(chǎn)物;建立膽固醇-半乳糖苷含量的HPLC分析方法;利用TLC、MS、IR、NMR等技術分析鑒定產(chǎn)物結(jié)構特征

4、。通過影響因素、加速試驗考察該配體的穩(wěn)定性。
　　2.膽固醇-半乳糖苷修飾的紫杉醇配體脂質(zhì)體的制備及理化性質(zhì)研究
　　在脂質(zhì)材料中加入適當比例(w％)的膽固醇-半乳糖苷，采用薄膜分散法，水化孵育、超聲、微孔濾膜過濾后，制備了紫杉醇配體脂質(zhì)體;通過單因素考察和正交設計法，優(yōu)選最佳處方，獲得質(zhì)優(yōu)、穩(wěn)定的脂質(zhì)體;考察紫杉醇配體脂質(zhì)體的外觀、粒徑、zeta電位、包封率。
　　3.紫杉醇配體脂質(zhì)體在SD大鼠體內(nèi)的藥物動力學及KM

5、小鼠組織分布學研究
　　以紫杉醇(Paclitaxel，PTX)為目標藥物，制備PTX-i普通注射液、PTX-L普通脂質(zhì)體和Gal-PTX-L配體脂質(zhì)體三種制劑;SD大鼠、KM小鼠作為動物模型，通過尾靜脈注射方式給藥，分別考察這三種紫杉醇制劑在機體內(nèi)的藥物動力學參數(shù)，以及在心、肝、脾、肺、腎等組織的分布;利用甲基叔丁基醚(MTBE)萃取法分離出血漿中的PTX，以多烯紫杉醇(Docetaxel，DOC)為內(nèi)標物計算PTX血藥濃度;D

6、AS2.1軟件分析藥物動力學數(shù)據(jù)。
　　4.紫杉醇配體脂質(zhì)體的體外抗HepG2細胞活性研究
　　在體外抗腫瘤試驗中，大量培養(yǎng)人肝癌細胞HepG2細胞株，接種適量HepG2細胞于96孔培養(yǎng)板，實驗分四組:陰性對照組、PTX注射液組、PTX-L組、Gal-PTX-L組，以給藥24-48-72h后，通過CCK(四唑單鈉鹽類)法和LDH(乳酸脫氫酶)法分別測定細胞存活率、三種含紫杉醇的藥物的IC50和細胞釋放的LDH活性(IU/L)

7、，進而綜合評價該Gal-PTX-L制劑的抗腫瘤療效優(yōu)勢。
　　結(jié)果:
　　1.膽固醇-半乳糖苷的酶促合成、分離純化、結(jié)構表征及穩(wěn)定性
　　利用酶法成功制備了膽固醇-半乳糖苷配體，考察了酶的種類、加酶量、反應介質(zhì)、反應溫度、底物摩爾比、反應時間等單因素對酶催化的影響，建立了Box-Behnken效應面模型，獲得最優(yōu)反應條件:乳糖醇(Lactitol，LA)與膽固醇癸二酸單烯酯(Cholesterylhemi-vinyl

8、sebacate，CHS-DD)摩爾比1∶3.7，Novozym43522.8mg，吡啶∶丙酮(2∶1，V/V)2.1mL，溫度55℃，反應時間31.2h，該條件下產(chǎn)率可達94％以上。通過簡單的柱層析流程，分離純化膽固醇-半乳糖苷配體分子。經(jīng)過TLC、MS、IR、NMR等技術，確證了產(chǎn)物的結(jié)構特征。根據(jù)影響因素試驗的結(jié)果，該配體的包裝應密封，放置在干燥、陰涼、避光處。
　　2.膽固醇-半乳糖苷修飾的紫杉醇配體脂質(zhì)體的制備及理化性質(zhì)

9、研究
　　以紫杉醇(PTX)為目標藥物，制得PTX普通脂質(zhì)體、PTX半乳糖基化脂質(zhì)體。建立了脂質(zhì)體中包合的PTX的HPLC含量測定法，通過線性、專屬性、精密度、回收率、重復性和穩(wěn)定性考察，證明該方法適用、可靠。選取藥脂比、磷脂與膽固醇比和膽固醇-半乳糖苷用量(w％)為考察對象，包封率(％)為評價指標，設計正交試驗優(yōu)化脂質(zhì)體制備工藝參數(shù)，獲得最佳工藝條件為:磷脂與藥物的質(zhì)量之比為4∶1，磷脂與膽固醇的質(zhì)量之比為5∶1，膽固醇-半乳糖

10、苷用量(w％)為8％。在最優(yōu)工藝下，制備三份樣品，顯示包封率86％以上，粒徑保持在160nm左右。
　　3.紫杉醇配體脂質(zhì)體在SD大鼠體內(nèi)的藥物動力學及KM小鼠組織分布學研究
　　首先建立了血漿中PTX濃度的LC-MS/MS測定方法，通過方法學考察證明了該方法適用、可行;考察了血液樣品的萃取藥物方法，證實甲基叔丁基醚萃取效果更佳，符合分析的要求;三種制劑經(jīng)大鼠尾靜脈給藥（5mg/kg）后，半衰期T1/2z(h)分別是4.26

11、±0.72(PTX-i)，2.83±1.28(PTX-L)，3.32±2.05(Gal-PTX-L);表觀分布容積Vz(L/kg)分別是9.44±2.28(PTX-i)，3.89±1.03(PTX-L)，16.11±6.23(Gal-PTX-L);清除率CLz(L/h/kg)分別為1.46±0.17(PTX-i)，1.12±0.35(PTX-L)，4.06±1.55(Gal-PTX-L)。另外，經(jīng)小鼠尾靜脈給藥后，紫杉醇普通脂質(zhì)體、紫杉

12、醇配體脂質(zhì)體肝靶向參數(shù)Re分別是0.105和4.103;Te(％)為3.083和56.112;RTe為0.117和2.105;Ce為0.109和3.298。
　　4.紫杉醇配體脂質(zhì)體的體外抗HepG2細胞活性研究
　　在0.1μg/mL劑量下，PTX-i組、PTX-L組、Gal-PTX-L組的24h細胞存活率分別為:50.08％，26.25％和11.38％;48h細胞存活率各是:45.84％，32.25％和19.17％;72

13、h細胞存活率為:43.03％，28.45％和24.85％。另外，三組藥物的IC50分別是0.438μg/mL，0.121μg/mL和0.037μg/mL。藥物干預后三組藥物的培養(yǎng)液中24hLDH的活性分別是20.14IU/L，27.67IU/L和39.37IU/L;48hLDH的活性分別是34.60IU/L，51.74IU/L和65.11IU/L;72hLDH的活性分別為48.98IU/L，65.20IU/L和80.91IU/L。

14、>　　結(jié)論:
　　綜上所述，膽固醇-半乳糖苷的合成及其紫杉醇配體脂質(zhì)體的研究，提供了一種新穎、高效和穩(wěn)定的將半乳糖基化脂質(zhì)體藥物運送至HepG2靶細胞并發(fā)揮抗腫瘤活性的途徑。通過藥物動力學和組織分布研究，確認了紫杉醇配體脂質(zhì)體比普通制劑具有更好的肝靶向性，更容易在肝臟蓄積;在體外抗肝腫瘤細胞研究中，表明紫杉醇配體脂質(zhì)體能夠發(fā)揮良好抑制肝腫瘤細胞生長的療效，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。因此，我們有理由相信紫杉醇配體脂質(zhì)體在肝