熱療對紫杉醇抑制肺腫瘤細胞的促進作用及其機制.pdf

1、肺癌的發(fā)病率和死亡率正在迅速上升,在很多發(fā)達國家,肺癌的發(fā)病率占男性常見惡性腫瘤的第一位,女性常見惡性腫瘤的第二、三位;肺癌的組織學類型也在發(fā)生顯著變化,腺癌的發(fā)病率不斷上升。雖然手術治療、化學治療、放射治療、免疫治療及綜合治療等都取得了長足發(fā)展,但在美國肺癌患者5年的生存率僅為15％,歐洲不過是10％,發(fā)展中國家則不到8.9％。化療藥物紫杉醇(TAX)抗腫瘤效果顯著,取得了較好的臨床療效。腫瘤熱療在腫瘤綜合治療中顯示了良好的效果,加熱

2、不會增加藥物的細胞毒性效應,所以,熱療增加腫瘤細胞對化療的敏感性受到越來越多的重視,因此,本研究旨在驗證熱療促進TAX對肺腫瘤細胞抑制作用的發(fā)生及其機制。
　　研究方法：1.熱療與TAX聯(lián)合應用對肺部細胞生物學特性的影響采用人肺腺癌A549細胞、人小細胞肺癌NCI-H446細胞和人呼吸道上皮BEAS-2B細胞,每種細胞分別采用3種方式處理,即對照組、TAX組和43℃+TAX組(見表1);倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài),照相記錄,噻唑藍比色

3、法檢測細胞增殖率;提取細胞總蛋白,按LDH Kit要求檢測LDH活力,劃痕實驗檢測細胞損傷修復能力,熒光Hoechst33342/PI雙染法以及提取細胞DNA Ladder檢測細胞凋亡。2.細胞內重要信號傳導通路在熱療與TAX誘導肺腫瘤細胞增殖過程中的作用及其相互關系采用人肺腺癌A549細胞和人小細胞肺癌NCI-H446細胞,每種細胞分別采用6種方式處理,即對照組、TAX組、43℃+TAX組(見表1)和SP600125組(43℃+TAX

4、組加入JNK信號轉導通路抑制劑SP600125)、wortmannin組(43℃+TAX組加入Akt通路抑制劑wortmannin)、NAC組(43℃+TAX組加入ROS抑制劑NAC);分別檢測各組ROS、p-JNK、p-Akt以及Caspase-3等的表達變化,并用流式細胞術檢測細胞凋亡率和細胞周期的變化,同時做體內實驗的驗證。3.HSP70在熱療與TAX抑制肺腫瘤細胞作用中的地位采用人肺腺癌A549細胞、人小細胞肺癌NCI-H446

5、細胞和人呼吸道上皮BEAS-2B細胞。每種細胞分別采用4種方式處理,即對照組、TAX組、43℃+TAX組和43℃組(見表1);檢測各組HSP70的表達變化,同時做體內實驗的驗證。4.GTSP1在熱療與TAX抑制肺腫瘤細胞過程中的作用構建重組質粒pcDNA3.0-GSTP1,轉染A549細胞,熱療聯(lián)合TAX處理轉染和未轉染細胞,倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài),照相記錄,噻唑藍比色法檢測細胞增殖率,流式細胞術檢測各組細胞周期的變化。5.統(tǒng)計學分析采

6、用SPSS12.0進行統(tǒng)計分析,統(tǒng)計學處理采用t檢驗、單因素方差分析,多重比較采用LSD法,構成比的比較采用卡方檢驗,以α=0.05為檢驗水準。
　　結果：1.熱療與TAX聯(lián)合應用對肺部細胞生物學特性的影響1.1熱療可以減少TAX對正常細胞的損傷作用(P<0.05),明顯增強TAX對肺腫瘤細胞的抑制作用(P<0.05);1.2熱療造成肺腫瘤細胞膜損傷,使得大量LDH外漏,所以檢測細胞內LDH發(fā)現(xiàn),43℃+TAX組的LDH較對照組和

7、TAX組明顯減少(P<0.05);1.3劃痕后24h,對照組細胞開始向劃痕區(qū)生長,其余各組劃痕區(qū)中央均未見細胞生長,且有部分細胞死亡,TAX組細胞存活數(shù)目多于43℃+TAX組;劃痕后48h,對照組細胞填滿劃痕區(qū),TAX組細胞部分存活,存在較寬的劃痕區(qū),43℃+TAX組細胞大多死亡;1.4用Hoechst33342結合PI染料對細胞進行雙染色,在熒光顯微鏡下觀察,呈現(xiàn)低綠色/低紅色的是正常細胞,高綠色/低紅色的是凋亡細胞,壞死細胞則為低綠

8、色/高紅色,對照組細胞呈低綠色和低紅色,證明細胞并未發(fā)生壞死和凋亡,TAX組細胞則綠色數(shù)量增加,紅色沒有變化,證明已有凋亡發(fā)生,43℃+TAX組細胞呈現(xiàn)明顯的亮綠色,證明細胞發(fā)生了明顯的凋亡,而并沒有發(fā)生壞死;1.543℃+TAX組細胞其DNA條帶出現(xiàn)典型的DNA片段梯帶現(xiàn)象(DNA ladder),而對照組細胞未出現(xiàn)DNA梯狀條帶,TAX組細胞的DNA梯狀條帶不明顯,說明熱療可以誘導肺腫瘤細胞發(fā)生凋亡。2.細胞內重要信號傳導通路在熱療

9、與TAX抑制肺腫瘤細胞過程中的作用及其相互關系2.1 ROS產(chǎn)生水平的變化熒光法檢測各組細胞內ROS,證明熱療可以明顯提高細胞內ROS的表達(P<0.05),ROS的增多可以改變細胞內氧化還原水平,損傷細胞膜,作為信號在細胞內傳遞,引起細胞內信號轉導通路的一系列變化。2.2 MKK4表達和p-JNK水平的變化43℃+TAX組的JNK信號轉導通路被激活,產(chǎn)生的MKK4和p-JNK高于對照組和TAX組(P<0.05),SP600125組的p

10、-JNK水平被抑制(P<0.05),wortmannin組二者表達均未見明顯變化(P>0.05),NAC組二者的水平均低于43℃+TAX組(P<0.05),說明熱療過程中產(chǎn)生的ROS可以激活JNK信號轉導通路。2.3 p-Akt水平的變化43℃+TAX組的Akt信號轉導通路被抑制,p-Akt的水平低于對照組和TAX組(P<0.05),wortmannin組的p-Akt水平完全被抑制(P<0.05),SP600125組的p-Akt水平低于

11、43℃+TAX組(P<0.05),NAC組的p-Akt水平明顯高于43℃+TAX組(P<0.05),說明熱療過程中產(chǎn)生的ROS可以抑制Akt通路的活化,同時,JNK信號轉導通路的激活影響Akt通路的活化。2.4 Caspase-3表達水平的變化43℃+TAX組的Caspase-3表達水平高于對照組和TAX組(P<0.05),SP600125組的Caspase-3表達水平低于43℃+TAX組(P<0.05),wortmannin組的Cas

12、pase-3表達水平高于43℃+TAX組(P<0.05),NAC組的Caspase-3表達水平完全被抑制(P<0.05),說明熱療誘導的細胞凋亡是ROS通過JNK和Akt2條通路傳給caspase途徑而引發(fā)的,且ROS、JNK信號轉導通路對caspase有活化作用,Akt通路對其有抑制作用。2.5細胞凋亡率和細胞周期的變化43℃+TAX組G0/G1期和G2/M期細胞增多,S期細胞減少(P<0.05),wortmannin組S期細胞更少(

13、P<0.05),SP600125組和NAC組S期細胞數(shù)目增加(P<0.05),G2/M期細胞減少(P<0.05);43℃+TAX組細胞凋亡率增加(P<0.05),wortmannin組細胞凋亡率進一步增加(P<0.05),而SP600125組和NAC組細胞凋亡率減少(P<0.05)。3.HSP70在熱療與TAX抑制肺腫瘤細胞作用中的地位對照組和TAX組的HSP70表達水平幾乎一致(P>0.05),43℃組和43℃+TAX組的HSP70表

14、達水平均較前兩組增加(P<0.05),且43℃+TAX組的HSP70表達水平低于43℃組(P<0.05),說明熱療誘導產(chǎn)生的HSP70,對不同性質的細胞產(chǎn)生不同的效應,熱療聯(lián)合TAX可能激活和/或抑制其他通路的激活,減弱了HSP70對肺腫瘤細胞的保護作用,但這個現(xiàn)象在正常細胞中沒有觀察到。4.GTSP1在熱療與TAX抑制肺腫瘤細胞過程中的作用成功構建pcDNA3.0-GSTP1真核表達載體后,轉染A549細胞,獲得轉染與未轉染的兩種A5

15、49細胞,MTT結果示,GSTP1本身對細胞生長沒有影響,轉染與未轉染細胞增殖率一致(P>0.05),GSTP1能促進化療藥物的代謝,不同濃度TAX作用后,未轉染組細胞增殖率低于轉染組細胞(P<0.05),43℃熱療聯(lián)合不同濃度TAX作用后,未轉染組細胞增殖率高于轉染組細胞(P<0.05);43℃熱療聯(lián)合TAX作用于轉染與未轉染細胞,流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn),G0/G1期和G2/M期細胞增多,S期細胞減少(P<0.05)。
　　結論及創(chuàng)

16、新點：1.在熱療的作用機制研究中,首次使用人呼吸道上皮BEAS-2B細胞作為研究對象,證明熱療可以減少化療藥物對正常細胞的損傷作用;熱化療聯(lián)合應用可以明顯增加化療藥物對肺腫瘤細胞生長的抑制作用,損傷肺腫瘤細胞膜,抑制肺腫瘤細胞的遷移,誘導肺腫瘤細胞凋亡的發(fā)生;2.通過使用通路抑制劑證明,熱療可以誘導ROS的產(chǎn)生,繼而激活JNK信號轉導通路和抑制Akt通路的活化,通過caspase途徑誘導細胞凋亡的發(fā)生,熱療主要作用于肺腫瘤細胞的S期,并

17、可使肺腫瘤細胞阻滯于G2/M期,從而促進TAX對肺腫瘤細胞的抑制作用,同時發(fā)現(xiàn),在熱療中,JNK信號轉導通路的激活可以調節(jié)Akt通路的活化狀態(tài),以上結論在體內實驗中得到證實;3.熱療誘導產(chǎn)生的HSP70,對不同性質的細胞產(chǎn)生不同的效應,熱化聯(lián)合的協(xié)同作用可能激活和/或抑制其他通路的激活,減弱了HSP70對肺腫瘤細胞的保護作用,因此比熱療能更好地抑制肺腫瘤細胞的生長,但在正常細胞中尚未觀察到這個現(xiàn)象;4.首次構建了pcDNA3.0-GST