轉(zhuǎn)錄因子CREB在紫杉醇抗腫瘤活性中的作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、背景意義：近年來大量研究表明，cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein, CREB）作為原癌性核轉(zhuǎn)錄因子，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，細(xì)胞接受外界刺激后活化一系列酶聯(lián)反應(yīng)，通過轉(zhuǎn)錄因子 CREB調(diào)控其靶蛋白的轉(zhuǎn)錄水平，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡過程。深入研究發(fā)現(xiàn)，CREB在調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞周期和細(xì)胞骨架均發(fā)生明顯改變。然而，在此過程中CREB所扮演的作用及其分

2、子機(jī)制尚需深入研究。
　　本課題以紫杉醇抑制宮頸癌細(xì)胞生長后，腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡過程中所引起的細(xì)胞周期和細(xì)胞骨架變化為研究對象，首先研究轉(zhuǎn)錄因子 CREB對細(xì)胞周期蛋白（cyclin）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的調(diào)控作用，尤其是在凋亡誘導(dǎo)劑（taxol）作用下 CREB是否參與調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程；其次使用鈣敏感受體（calciumsensing receptor，CaSR）活化劑（Gdcl3）、抑制劑（NPS2390）探討C

3、aSR對細(xì)胞內(nèi)Ca2+（Intracellular calcium concentration,[Ca2+]i）以及CREB的影響；第三，深入研究CaSR對細(xì)胞骨架纖維排列及其亞型基因表達(dá)作用；最后，通過構(gòu)建CREB負(fù)顯性突變體（PM）研究凋亡細(xì)胞內(nèi)CaSR調(diào)控的細(xì)胞骨架亞型基因表達(dá)改變是否受CREB所介導(dǎo)。
　　研究方法：
　?。?）MTT實(shí)驗(yàn)確定紫杉醇的最佳濃度和處理時間；
　?。?）PCR技術(shù)構(gòu)建pCI neo/

4、CREB（PN）重組質(zhì)粒及pCI neo/CREB-M（PM）定點(diǎn)突變質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后觀察其對cyclins、CDKs和細(xì)胞骨架亞型基因表達(dá)的影響；
　　（3）流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期；
　?。?）Western blot檢測pCREB、CREB、cyclins以及CDKs蛋白表達(dá)；（5）免疫熒光技術(shù)檢測[Ca2+]i濃度以及細(xì)胞骨架纖維排列變化；
　　（6）Real-time PCR檢測細(xì)胞骨架亞型基因表達(dá)；（7）免疫組織

5、化學(xué)技術(shù)觀察組織蛋白表達(dá)量。
　　研究結(jié)果：
　?。?）紫杉醇誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，G0/G1期和S期細(xì)胞數(shù)量顯著性減少，呈時間和濃度依賴性；同時誘導(dǎo)cyclin A表達(dá)量下調(diào)，cyclin B1和cyclin D1表達(dá)量顯著性上調(diào);然而，CREB負(fù)顯性抑制劑PM聯(lián)合紫杉醇處理后顯著性逆轉(zhuǎn)了cyclin A下調(diào)、cyclin B1和D1上調(diào)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯的解除；
　?。?）紫杉醇誘導(dǎo) HeLa細(xì)胞

6、[Ca2+]i上調(diào)，同時 MTs聚集成束狀結(jié)構(gòu)并包繞于細(xì)胞核外圍，而 MFs向細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)聚集；深入研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇處理后β-actin,γ-actin,α-tubulin和β-tubulin四種細(xì)胞骨架亞型基因均顯著性下調(diào)，然而，上述現(xiàn)象被NPS2390/Gdcl3與紫杉醇聯(lián)合處理所抑制/增強(qiáng)。此外，PM逆轉(zhuǎn)了Gdcl3對γ-actin,α-tubulin和β-tubulin的抑制作用；
　?。?）紫杉醇誘導(dǎo) HeLa細(xì)胞內(nèi) pC

7、REB水平顯著性上調(diào)，并且呈 CaSR活性依賴性；此外，pCREB在腫瘤組織/細(xì)胞高于正常組織/細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　?。?）紫杉醇通過誘導(dǎo)pCREB水平上調(diào)，從而下調(diào)cyclin A，上調(diào)cyclin B1和cyclin D1表達(dá)量，最終誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，G0/G1期和S期細(xì)胞數(shù)量顯著性減少；
　?。?）CaSR參與調(diào)控紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架排列及其亞型基因表達(dá)變化，然而這個過程受轉(zhuǎn)錄因子CREB所介