人源抗EGFR重組Fab的篩選及其免疫標(biāo)記紫杉醇體外抗腫瘤作用的研究.pdf

1、研究目的： 1．篩選人源性抗表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)重組抗原結(jié)合片段(fragment for antigen binding，F(xiàn)ab)抗體； 2．表達(dá)純化抗EGFR Fab； 3．對(duì)抗EGFRFab功能進(jìn)行鑒定； 4．標(biāo)記化療藥物紫杉醇于Fab，觀察其體外抗腫瘤效果。 研究方法： 1．通過固相篩選法或聯(lián)合固相篩選法與基

2、于細(xì)胞表面的差減篩選法從噬菌體抗體庫進(jìn)行抗體片段篩選，通過酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)進(jìn)行陽性克隆的鑒定，并測(cè)定比較其可變區(qū)序列； 2．于大腸桿菌Top 10F’中表達(dá)Fab，并通過固相金屬鏊合親和層析技術(shù)與離子交換技術(shù)進(jìn)行兩步法抗體純化； 3．應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)、免疫沉淀、熒光激動(dòng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)以及免疫熒光技術(shù)對(duì)純化的抗體特異性進(jìn)行鑒定；通過非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)計(jì)算親和力；通過標(biāo)記皂角素的抗人免疫球蛋白試劑盒觀察該重組抗體與腫瘤細(xì)

3、胞表面EGFR結(jié)合后的內(nèi)化能力； 4．將紫杉醇標(biāo)記到Fab，通過MTT法觀察不同濃度標(biāo)記的紫杉醇對(duì)腫瘤細(xì)胞株A431以及正常細(xì)胞系NIH/3T3增殖的影響，比較相同濃度標(biāo)記/非標(biāo)記的紫杉醇對(duì)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞株A431增殖的影響；通過TUNEL assay觀察免疫標(biāo)記藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用。 研究結(jié)果： 1．基于CV-1/EGFR-1細(xì)胞株的篩選得到了兩株親和力較低的輕鏈為K鏈的Fab，而聯(lián)合運(yùn)用固相篩選與

4、基于NIH/3T3與A431細(xì)胞株的篩選得到了具有一定親和力的入鏈Fab； 2．Fab在一定條件下可以經(jīng)誘導(dǎo)于Top 10F’中表達(dá)，并經(jīng)兩步純化法得到較高純度的蛋白； 3．功能鑒定證實(shí)抗：EGFR Fab能夠與腫瘤細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞表面具有天然構(gòu)象的EGFR結(jié)合；結(jié)合解離常數(shù)約為30.9 nM；結(jié)合后能夠內(nèi)化； 4．標(biāo)記于Fab的紫杉醇作用強(qiáng)度提高4.5倍，在未標(biāo)記紫杉醇無明顯作用時(shí)即引起細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞系