p53可調控的uc.106對b細胞淋巴瘤細胞株38b9的作用研究

1、馬禮丹：p 5 3 可調控的t i c ．1 0 6 + 對B 細胞淋巴瘤細胞株3 8 8 9 的作用研究p 5 3 可調控的U C ．1 0 6 + 對B 細胞淋巴瘤細胞株3 8 8 9 的作用研究摘 要【目的】B u r k i t t ’S 淋巴瘤的主要患者是兒童和青少年，其預后大多不良。目前許多研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼R N A ( L o n g n o n c o d i n g R N A s ，l n c R N A s )

2、與人類腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，并逐漸應用于人類腫瘤疾病的預防和治療。超保守R N A ( U l t r a c o n s e r v e d R N A s ，U C R s ) 是1 n c ．R N A s 的一種。本課題組前期研究中將P 5 3 可控性表達小鼠( P 5 3 ．E R r d ) 骨髓細胞和產c ．m y c病毒包裝細胞混合注入小鼠皮下，形成B 細胞淋巴瘤模型。當向小鼠注射4 ．羥基拓馬西酚( 4 -

3、 O H T ) 激活P 5 3 后，腫瘤細胞發(fā)生明顯凋亡。取P 5 3 激活后腫瘤細胞，進行超保守R N A的高通量檢測，發(fā)現(xiàn)部分超保守R N A 的水平在P 5 3 激活后明顯下調。本研究旨在驗證芯片數(shù)據(jù)中超保守R N A 的表達，并選擇下調趨勢明顯的U C ．1 0 6 + 研究其對B 細胞淋巴瘤生長的調控及其作用機制。【方法】1 ．取4 ．羥基拓馬西酚( 4 ．O H T ) 激活P 5 3 的小鼠B 細胞淋巴瘤細胞，實時定量P

4、 C R 檢測前期芯片數(shù)據(jù)中所篩選的5 個U C R 的表達水平。并在小鼠正常B 細胞和小鼠B 淋巴瘤細胞( 3 8 8 9 ) 中進行驗證。2 ．構建所篩選出的U C ．1 0 6 + 的表達質粒并包裝得到病毒，將得到的病毒感染B 細胞淋巴瘤細胞( 3 8 8 9 ) ，使細胞過表達U C ．1 0 6 + 。通過細胞計數(shù)檢測細胞增殖情況。3 ．制作荷瘤小鼠模型：將3 8 8 9 細胞和空載體p M S C V 直接感染3 8 8 9

5、 得到的細胞( 3 8 8 9 一M S C V ) 以及用U C ．1 0 6 + 的表達質粒包裝得到病毒感染3 8 8 9 后的細胞( 3 8 8 9 ．M S C V - u c ．1 0 6 + )分別打入小鼠皮下。2 周后取出荷瘤小鼠腫瘤，測量腫瘤大小及重量；提取腫瘤組織蛋白，用W e s t e r n B l o t 檢測U C ．1 0 6 + 基因序列所在的宿主基因O L A l 蛋白的表達?！窘Y果】1 ．r t ．q

6、 P C R 檢測結果顯示U C ．3 + 、U C ．1 0 6 + 、U C ．1 7 2 + 、U C ．2 6 3 + 、U C ．2 8 1 + A 在P 5 3 激活1 ．5 h 、3 h 時后表達水平明顯下調。其中H e ．1 0 6 + 在小鼠B 淋巴瘤細胞中的表達亦顯著低于正常小鼠B 淋巴細胞。選取下調趨勢較為顯著的U C ．1 0 6 + 進一步研究其對B 淋巴瘤的影響。馬禮丹：p 5 3 可調控的H C ．1 0

7、6 + 對B 細胞淋巴瘤細胞株3 8 8 9 的作用研究S t u d y o f t h ee f f e c t so f p 5 3 i n d u c e d U C ．1 0 6 + o n B c e l l[ A i m s 】l y m p h o m a g e n e s i s c e l ll i n e3 8 8 9。。，舳s t r a c t ＼㈣必P a t i e n t so f B u r k i

8、t t ’Sl y m p h o m a ，t h e p r o g n o s i s o f w h i c h i sp o o r ，a r e m a i n l y c h i l d r e na n da d o l e s c e n t s ．A t p r e s e n t ，m a n y s t u d i e sh a v e f o u n d t h a tl o n g n o n c o d i

9、 n g R N A s ( 1 n c R N A s ) i sc l o s e l ya s s o c i a t e dw i t h t h e d e v e l o p m e n t a n d p r o g r e s s i o n o f h u m a n t u m o r d i s e a s e s ．T h u s ，l n c R N A s a r e g r a d u a l l y a

10、p p l i e dt ot h e p r e v e n t i o na n d t r e a t m e n t o f h u m a n c a n c e r s ．U l t r a c o n s e r v e dR e g i o n s ( U C R s ) a r e a k i n d o f l n c R N A s ．O u r r e s e a r c hg r o u p h a d u s

11、 e d m o u s e b o n em a r r o w c e l l sw i t h c o n t r o l l a b l ee x p r e s s i o no f P 5 3 ( P 5 3 一E R K I ) a n d c e l l sw i t h c - m y c o v e r e x p r e s s i o nt oe s t a b l i s ha m o u s e m o d

12、e l o f B - l y m p h o m a ．I n j e c t i o nw i t h 4 - h y d r o x y t a m o x i f e n t oa c t i v a t eP 5 3 C a ni n d u c em o s t o f t h e t u m o r c e l l sa p o p t o s i s ．T h e e x p r e s s i o no f u l t

13、 r a - c o n s e r v e d R N A s w e r ed e t e c t e di nt u m o r c e l l s w i t h P 5 3 a c t i v a t i o nu s i n g m i c r o a r r a y ．S o m e u l t r a - c o n s e r v e d R N A s ’l e v e l i nP 5 3a c t i v a t

14、 e d t u m o r c e l l s d r o p p e d m a r k e d l y ．T h i ss t u d ya i m sa t v e r i f i c a t i n gt h e e x p r e s s i o no f 5 o ft h e s e U C R s a n d s e l e c t i n g o n e o f t h e m U C ．1 0 6 + t o e x

15、 p l o r e t h e e f f e c to f i to n t h e g r o w t ho f B c e l ll y m p h o m a a n d t h e p o t e n t i a l m e c h a n i s m ．[ M e t h o d s ]1 ．T h ee x p r e s s i o n o f 5 U C R s i nt u m o r c e l l s w i

16、t h P 5 3a c t i v a t i o n w e r ed e t e c t e du s i n g r e a l - t i m eq u a n t i t a t i v e P C R ．A m o n g t h e5U C R s ，w e s e l e c t e dU C ．1 0 6 + f o r f u r t h e rs t u d y ．W e u s e d r e a l —t i

17、 m eq u a n t i t a t i v eP C R t od e t e c tt h e e x p r e s s i o n o f u c ．10 6 + i n B l y m p h o c y t e c e l l sa n d B l y m p h o m a sc e l l s ( 3 8 8 9 ) o f m i c e ．2 ．T oi n v e s t i g a t e t h e i

18、n f l u e n c e o f u c ．1 0 6 + o n t h eB —l y m p h o m a ，w e c o n s t r u c t e dr e c o m b i n a n tp l a s m i d o f u c ．1 0 6 + - p M S C V —P I Ga n d g a i n e d t h e t h e r e t r o v i r u sb y p a c k a

19、g i n g c e l l s ．T h e nw et r a n s f e c t e dB c e l ll y m p h o m a w i t ht h e r e t r o v i r u st oo v e r e x p r e s s U C ．10 6 + ．C e l lc o u n t i n g w a s u s e dt od e t e c tt h e c e l lp r o l i f

20、e r a t i o n ．3 ．B y i n j e c t i n g 3 8 8 9 c e l l si n f e c t e dw i t h v i r u sp r o d u c e df r o m e m p t y v e c t o r o rf r o m U C ．10 6 + -p M S C V —P I G ，w e m a d e a t u m o r - b e a r i n g m i

21、c e ．W et o o k o u tt h e t u m o r a f t e r 2w e e k s a n dm e a s u r e d t h es i z ea n d w e i g h t o f t h e t u m o r s ．N e x t ，w ee x t r a c t e dt h e t o t a lp r o t e i no f t h e t u m o r t od e t e