MicroRNA-155與NK-T細(xì)胞淋巴瘤臨床特征的關(guān)系及對人NK-T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SNK-6的生長調(diào)控的研究.pdf

1、目的:通過檢測miR-155在NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者外周血及人K/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SNK-6細(xì)胞中的表達(dá)，探索其與NK/T細(xì)胞淋巴瘤臨床特征的相關(guān)性及其可能的作用機(jī)制，以期尋找NK/T細(xì)胞淋巴瘤新的腫瘤標(biāo)記物及預(yù)后預(yù)測指標(biāo)。
　　方法:
　　1研究對象:患者血液標(biāo)本來自于2013年～2014年3月間，就診于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院血液科的NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者。所有患者均簽署知情同意書。正常人外周血來自于河北醫(yī)科大學(xué)自愿者。人

2、NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SNK-6細(xì)胞獲贈于鄭州大學(xué)第一附院。
　　2人NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SNK-6細(xì)胞培養(yǎng)、傳代:人NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SNK-6細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)約為15％人AB型血漿、1000u/ml的白介素-2、RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、飽和濕度、5％CO2條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48-72h傳代一次。此時(shí)細(xì)胞生長良好，懸浮成團(tuán)，臺盼蘭染色拒染率95％以上。本研究相關(guān)實(shí)驗(yàn)均采用對數(shù)生長期SNK-6細(xì)胞進(jìn)

3、行。
　　3基因組miRNA提取:應(yīng)用miRNA提取試劑盒提取NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者、正常人外周血標(biāo)本及SNK-6細(xì)胞中的基因組miRNA，以及應(yīng)用Trizol法提取SNK-6細(xì)胞株中的total RNA，提取后將其置于-115℃恒溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>　　4應(yīng)用Realtime-PCR法檢測miR-155表達(dá)水平，并分析其與患者預(yù)后因素的相關(guān)性。
　　5使用siRNA封閉SNK-6細(xì)胞中的miR-155后，應(yīng)用MTT法

4、檢測細(xì)胞增殖的影響。
　　取SNK-6細(xì)胞隨機(jī)分為未處理組、封閉同源性siRNA對照組和封閉miR-155實(shí)驗(yàn)組，siRNA對照組及實(shí)驗(yàn)組分別加入siRNA-同源性序列/EndoFectionTM復(fù)合物、siRNA-155/EndoFectionTM復(fù)合物，作用于細(xì)胞48小時(shí)后離心收集細(xì)胞，后取未處理的細(xì)胞、封閉同源性siRNA對照組和封閉miR-155實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞，均調(diào)整密度約為2×105/ml，按200μl/孔接種于U型96孔

5、板，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)空，置于37℃、5％CO2、飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中孵育，于第24h向各孔中加入20μl MTT(5mg/ml)溶液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4小時(shí)，后2500轉(zhuǎn)/分鐘，離心培養(yǎng)板20分鐘，吸去上清，每孔內(nèi)加入150μl二甲基亞砜，振蕩器振蕩至結(jié)晶溶解，于酶標(biāo)儀490nm條件下，測定各孔的吸光度值(OD值)。
　　6封閉miR-155后使用Realtime-PCR檢測細(xì)胞中NF-κB mRNA表達(dá)水平的變化。
　

6、　取SNK-6細(xì)胞隨機(jī)分為未處理組、封閉同源性siRNA對照組和封閉miR-155實(shí)驗(yàn)組，siRNA對照組及實(shí)驗(yàn)組分別加入siRNA-同源性序列/EndoFectionTM復(fù)合物、siRNA-155/EndoFectionTM復(fù)合物，作用于細(xì)胞48小時(shí)后，根據(jù)RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒具體實(shí)驗(yàn)步驟檢測NF-κB的mRNA表達(dá)水平。
　　7統(tǒng)計(jì)分析:所有數(shù)據(jù)結(jié)果分析應(yīng)用的SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，

7、P＜0.05，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性分布的數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，不滿足正態(tài)性分布的數(shù)據(jù)采用秩轉(zhuǎn)換的非參數(shù)檢驗(yàn)對患者及正常人外周血兩組miR-155基因表達(dá)差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用x2檢驗(yàn)、多因素分析等對miR-155的表達(dá)與NK/T細(xì)胞型淋巴瘤患者臨床特征進(jìn)行頻率分析。
　　結(jié)果:
　　1全部研究對象中，NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者miR-155表達(dá)水平高于正常對照組，說明miR-155在NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者外周血中存在

8、異常高表達(dá)。
　　2在人NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SNK-6細(xì)胞中miR-155存在異常高表達(dá)。
　　3 MiR-155在NK/T細(xì)胞淋巴瘤臨床特征中的分布頻率分析，結(jié)果顯示miR-155與骨髓浸潤、分期、Ki-67(％)及NKPI相關(guān)，即miR-155的表達(dá)水平越高，骨髓浸潤幾率越大，疾病分期越晚及疾病的危險(xiǎn)因素越多。由于以上指標(biāo)與NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者預(yù)后相關(guān)，說明miR-155可能影響其預(yù)后。
　　4由于Ki-67

9、(％)是腫瘤細(xì)胞增殖活性的一項(xiàng)指標(biāo)，因此miR-155可能與腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)。在miR-155封閉后，MTT結(jié)果顯示SNK-6細(xì)胞存活率明顯降低，證明miR-155表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖活性。
　　5 Realtime-PCR方法檢測封閉miR-155后的細(xì)胞中NF-κB mRNA下調(diào)，提示NF-κB信號通路是miR-155參與NK/T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生機(jī)制之一。
　　結(jié)論:
　　1在NK/T細(xì)胞淋巴瘤中miR-155存在