PTEN在NK-T細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)及意義.pdf

1、NK/T細(xì)胞淋巴瘤(NaturalKillerT-CellLymphoma，NKTCL)為非霍奇金淋巴瘤的一個(gè)亞型，發(fā)病率居T細(xì)胞淋巴瘤的首位，具有獨(dú)特流行病學(xué)分布特征，在東亞及拉丁美洲地區(qū)多見(jiàn)，而在歐美國(guó)家少見(jiàn)，具體的發(fā)病原因仍不明確，通常認(rèn)為與EB病毒感染及慢性鼻炎有關(guān)，也有學(xué)者認(rèn)為遺傳因素可能在其中起到一定的作用，是近年來(lái)淋巴瘤研究的熱門。
　　PTEN基因稱之為第10號(hào)染色體缺失性磷酸酶-張力蛋白同源性基因(phospha

2、taseandtensinhomologydeletedonchromosomeTen,PTEN)，是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因，研究發(fā)現(xiàn)PTEN可能通過(guò)對(duì)酪氨酸的磷酸化的抑制作用、負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖作用，同時(shí)參與細(xì)胞周期的調(diào)控作用，其突變、缺失，蛋白表達(dá)異常，最終可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。PTEN的研究已成為腫瘤學(xué)特別是淋巴造血系統(tǒng)腫瘤研究的熱點(diǎn)，但在NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的研究較少，PTEN基因及其通路對(duì)NK/T細(xì)胞淋巴瘤有何生物

3、學(xué)特性影響及其分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。
　　本課題首先在臨床患者腫瘤組織標(biāo)本中檢測(cè)PTEN基因表達(dá)情況，然后利用慢病毒載體和RNAi技術(shù)，構(gòu)建分別攜帶PTENcDNA和shPTEN的重組慢病毒載體，感染NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系，研究PTEN基因?qū)τ贜K/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、凋亡誘導(dǎo)、細(xì)胞周期、化療藥物敏感性等生物學(xué)特性的作用，同時(shí)檢測(cè)相關(guān)分子通路基因，探索PTEN基因在NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的生物學(xué)功能和分子機(jī)制，為N

4、K/T細(xì)胞淋巴瘤的臨床診治提供潛在的分子標(biāo)志物和靶基因。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　1.檢測(cè)PTEN基因在NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織以及反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組織表達(dá)情況，分析與臨床病理參數(shù)、療效之間的關(guān)系。
　　2.構(gòu)建并制備攜帶PTENcDNA和PTEN-shRNA的重組慢病毒載體，并進(jìn)行相關(guān)功能鑒定。
　　3.檢測(cè)PTEN基因在NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系SNK-6和正常NK細(xì)胞中的表達(dá)，研究PTEN基因的表達(dá)對(duì)SNK-6細(xì)胞

5、生長(zhǎng)增殖、凋亡、細(xì)胞周期、化療藥物敏感性等生物學(xué)特征的影響，檢測(cè)PTEN相關(guān)分子通路和耐藥基因的表達(dá)，初步明確相關(guān)分子機(jī)制。
　　主要內(nèi)容:
　　第一部分:PTEN在NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織中的表達(dá)及意義
　　方法:
　　1.HE染色（蘇木精伊紅染色）:石蠟組織包埋切片進(jìn)行脫蠟，染色，脫水后觀察NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織中腫瘤細(xì)胞形態(tài)和組織學(xué)特點(diǎn)。
　　2.免疫組化檢測(cè)PTEN蛋白在NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá):經(jīng)

6、過(guò)脫蠟，抗原修復(fù)，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，一抗孵育，二抗孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片過(guò)程，顯示在NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織中PTEN的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞呈彌漫浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，組織壞死明顯，粘膜面有潰瘍形成，腫瘤細(xì)胞形態(tài)單一、中等大小，胞質(zhì)淡染至透亮，浸潤(rùn)并破壞血管壁。免疫組化結(jié)果顯示PTEN在NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織中陽(yáng)性表達(dá)率為32.0％(16/50)，顯著低于反應(yīng)性增生淋巴結(jié)86.7％

7、(26/30)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2.PTEN在NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系:NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織中PTEN陽(yáng)性表達(dá)率與患者年齡、性別、發(fā)生部位、臨床分期、乳酸脫氫酶(LDH)水平均無(wú)相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與Ki-67指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。根據(jù)療效評(píng)價(jià)（2周期）可將淋巴瘤患者分為治療有效組(CR+PR)和治療無(wú)效組(SD+PD)，結(jié)果顯

8、示PTEN在NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)陽(yáng)性率在有效組(42.1％)明顯高于無(wú)效組(16.1％)（P＜0.05）。
　　第二部分:攜帶PTENcDNA和shRNA重組慢病毒的制備和感染效率測(cè)定
　　方法:
　　1.PTEN高表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建:將pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP載體用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，PTEN克隆載體為模版PCR產(chǎn)物用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，連接轉(zhuǎn)化構(gòu)建PTEN基因高表達(dá)慢病毒

9、載體pCDH-PTEN。
　　2.PTEN干擾表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建及干擾效率篩選:設(shè)計(jì)合成PTEN基因shRNA，退火形成雙鏈片段，干擾慢病毒載體pLL3.7用HpaⅠ和XhoⅠ酶切，通過(guò)連接，轉(zhuǎn)化鑒定，構(gòu)建PTEN基因干擾慢病毒載體pLL-shPTEN1，pLL-shPTEN2和pLL-shPTEN3。通過(guò)RealtimePCR鑒定篩選出高效干擾的pLL-shPTEN。
　　3.慢病毒包裝，純化，濃縮及滴度測(cè)定:共轉(zhuǎn)染慢病毒

10、載體，包裝質(zhì)粒Δ8.2和包膜質(zhì)粒VSV-G于293T細(xì)胞中，72h收獲病毒，通過(guò)高速離心法進(jìn)行純化濃縮病毒，通過(guò)梯度稀釋法進(jìn)行滴度測(cè)定。
　　4.慢病毒對(duì)淋巴細(xì)胞感染效率測(cè)定:用不同MOI=0.1，1，10，100，1000對(duì)正常淋巴瘤細(xì)胞感染后通過(guò)熒光觀察測(cè)定綠色熒光細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)有GFP表達(dá)的細(xì)胞比例。
　　結(jié)果:
　　1.pCDH-PTEN慢病毒表達(dá)載體酶切鑒定正確，測(cè)序結(jié)構(gòu)與NCBI中

11、參考序列一致，說(shuō)明PTEN基因高表達(dá)慢病毒載體pCDH-PTEN構(gòu)建成功。
　　2.酶切及測(cè)序結(jié)果顯示pLL-shRNA1，pLL-shRNA2和pLL-shRNA3構(gòu)建成功，其中pLL-shRNA2干擾效率最高，選擇pLL-shRNA2進(jìn)行下面病毒包裝。
　　3.通過(guò)慢病毒感染結(jié)果可知Lenti-con，Lenti-PTEN以及Lenti-shPTEN慢病毒包裝成功，并且純化濃縮后病毒滴度可以達(dá)到109IFU/ml。

12、>　　4.通過(guò)對(duì)SNK-6和YTS細(xì)胞的感染效率的測(cè)定發(fā)現(xiàn)當(dāng)MOI=100時(shí)病毒感染效率可以達(dá)到60％以上，可以滿足下游實(shí)驗(yàn)需求。
　　第三部分:重組慢病毒Lenti-PTEN及Lenti-shPTEN功能測(cè)定和對(duì)SNK-6細(xì)胞生物學(xué)特性影響
　　方法:
　　1.RealtimePCR及WesternBlot分析正常NK細(xì)胞和SNK-6細(xì)胞中PTEN基因mRNA和蛋白表達(dá)水平。重組慢病毒Lenti-PTEN和Lenti

13、-shPTEN感染正常NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞和SNK-6細(xì)胞后，利用RealtimePCR及WestemBlot檢測(cè)PTEN基因表達(dá)。
　　2.重組慢病毒感染SNK-6細(xì)胞后，為評(píng)價(jià)PTEN基因?qū)α馨土黾?xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力變化。重組慢病毒感染SNK-6細(xì)胞和正常NK淋巴細(xì)胞后，利用流式細(xì)胞儀通過(guò)細(xì)胞周期及凋亡檢測(cè)試劑盒分析PTEN基因?qū)θ肆馨土黾?xì)胞周期及凋亡的影響。重組慢病毒感染SNK-6細(xì)胞

14、和正常NK淋巴細(xì)胞后，通過(guò)不同濃度順鉑（8.0μg/mL、2.0μg/mL、0.5μg/mL、0.125μg/mL、0.03125μg/mL、0μg/mL）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，CCK8檢測(cè)藥物作用后細(xì)胞增殖情況。
　　3.重組慢病毒感染SNK-6細(xì)胞，通過(guò)WesternBlot分析PI3K/AKT通路和耐藥基因蛋白表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果:
　　1.RealtimePCR以及westernblot分析結(jié)果表明均表明，PTE

15、N基因在正常NK細(xì)胞和NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系SNK-6中均有表達(dá)，較正常NK細(xì)胞相比，SNK-6細(xì)胞中表達(dá)量明顯下降。另外，重組慢病毒感染SNK-6細(xì)胞后，高表達(dá)PTEN的重組慢病毒感染SNK-6細(xì)胞系后，SNK-6細(xì)胞中PTEN的表達(dá)明顯增高(P＜0.05)，干擾PTEN基因表達(dá)的重組慢病毒感染SNK-6細(xì)胞系后，SNK-6細(xì)胞中PTEN的表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，降低了70％以上。
　　2.重組慢病毒Lenti-PTEN

16、作用后的淋巴瘤細(xì)胞不同程度出現(xiàn)細(xì)胞病理變化，即生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞分散，可見(jiàn)不同程度細(xì)胞碎片，細(xì)胞折光度欠佳，細(xì)胞攣縮。重組慢病毒Lenti-shPTEN作用SNK-6細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增長(zhǎng)速度稍有增加，細(xì)胞狀態(tài)與對(duì)照組及Lenti-con相比差別不大。重組慢病毒Lenti-PTEN對(duì)于SNK-6細(xì)胞的抑制作用明顯(P＜0.05)，達(dá)到了42.03％±5.15，而重組慢病毒Lenti-shPTEN感染組相對(duì)Lenti-con組對(duì)SNK-6細(xì)

17、胞的增殖作用無(wú)明顯差異（P＞0.05）。重組慢病毒Lenti-PTEN可以通過(guò)誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡，抑制淋巴瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。不同濃度梯度DDP對(duì)SNK-6細(xì)胞作用呈現(xiàn)明顯濃度劑量依賴性，即隨濃度劑量的提高，DDP對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率持續(xù)上升，重組病毒Lenti-con組和Lenti-shPTEN組細(xì)胞對(duì)DDP的增殖抑制率無(wú)明顯變化(P＜0.05)。重組慢病毒Lenti-PTEN感染后，細(xì)胞增殖抑制率較其他各組相比，抑制率均明顯提高（P＜0

18、.05），同時(shí)DDP對(duì)重組慢病毒Lenti-PTEN作用后SNK-6細(xì)胞的IC50值（0.0894±0.0073）較其他各組明顯下降(P＜0.05)，表明PTEN基因可以增強(qiáng)化療藥物順鉑對(duì)SNK-6細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。
　　3.PTEN基因的高表達(dá)可以明顯抑制PI3K、p-Akt、mTOR、ABCC4基因的表達(dá)，但對(duì)MDR-1影響不明顯。
　　結(jié)論:
　　1.PTEN基因在NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織和細(xì)胞系中相對(duì)低表達(dá)。NK

19、/T細(xì)胞淋巴瘤組織中PTEN陽(yáng)性表達(dá)率與Ki-67指數(shù)和療效呈負(fù)相關(guān)。提示PTEN可能與NK/T細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，并有可能作為療效判定的潛在分子標(biāo)志物。
　　2.成功包裝出三種重組慢病毒lenti-PTEN和lenti-shPTEN，可有效感染NK/T細(xì)胞淋巴瘤SNK-6和YTS細(xì)胞株，并顯著提高和降低NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系SNK-6細(xì)胞中PTEN基因的表達(dá)。
　　3.PTEN基因的表達(dá)可以有效抑制SNK-6細(xì)胞