dna重組克隆的單元操作

1、第 2 章DNA重組克隆的單元操作,,DNA重組的載體； DNA的體外重組； 重組DNA分子的轉(zhuǎn)化與擴增； 轉(zhuǎn)化子的篩選與重組子的鑒定； 目的基因的克隆。,2.1 用于基因克隆的載體,質(zhì)粒（plasmid）,,噬菌體,考斯質(zhì)粒（cosmid）與噬菌粒,人造染色體載體,,,,載體的功能及特征,,載體的功能及特征,1.載體的功能,① 為外源基因提供進入受體細胞的轉(zhuǎn)移能力,② 為外源基因提供復制能力或整合能力,③ 為外源基因的擴

2、增或表達提供必要的條件,,,2.載體應具備的條件,① 具有針對受體細胞的親緣性或親和性。,③ 具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點。,④ 具有合適的篩選標記。,② 具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點。,質(zhì)粒,1.質(zhì)粒的基本特征,質(zhì)粒是生物細胞內(nèi)固有的、能獨立于寄主染色體而自主復制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子。,質(zhì)粒常見于原核細菌和真菌中。,絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的。,絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)。,

3、質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1 - 100 kb。,,,質(zhì)粒的自主復制性：拷貝數(shù)的控制機制 – 質(zhì)粒DNA復制啟動控制,控制復制引物與模板的結(jié)合,,,,,,ori,E.coli ColE1 plasmid,,,,,,,,,,,,,復制方向,,rop,,,,,,,,,,,（+）,Rop,RNA II,RNA I,3’,5’,5’,3’,質(zhì)粒,質(zhì)粒的基本特征,質(zhì)粒的自主復制性：拷貝數(shù)的控制機制 – 質(zhì)粒DNA復制啟動控制,控制復制起始因子與復

4、制起始位點（ori）的結(jié)合,,Pcop,cop,P/Orep,rep,ori,,,,,,,,,,,,Cop,Rep,可擴增性,根據(jù)在每個細胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)粒可分為,兩大復制類型：,嚴緊型復制控制的質(zhì)粒 1 - 5 拷貝 stringent plasmid,松弛型復制控制的質(zhì)粒 30 - 50 拷貝 Relaxed plasmid,,質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性,革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾?① 接合型質(zhì)粒： 能在天然條件下

5、自發(fā)地從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一,個細胞（接合作用）。,② 非接合型質(zhì)粒：不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用。,質(zhì)粒的不相容性,任何兩種含有相似復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時,存在于一個細胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性。,以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：,ColE1、pMB1 擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容,pSC101、F擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容,攜帶特殊的遺傳標記,物質(zhì)抗性：抗生素、重金屬離子、紫外線、X射線,物質(zhì)合成：細菌毒素、有機堿

6、,這些標記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義。,,2.質(zhì)粒的改造與構(gòu)建,野生型質(zhì)粒分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想。目前實驗室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多由pSC101、ColE1和pSF2124構(gòu)建。,① 刪除非必需區(qū)域DNA。② 滅活某些質(zhì)粒的編碼基因。如mob基因，負調(diào)控基因③ 加入標記基因。④ 添加MCS，刪除重復酶切位點。⑤ 加上一些調(diào)控序列。,3.質(zhì)粒的分類,,人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下

7、幾類：,高拷貝質(zhì)粒 擴增基因,低拷貝質(zhì)粒 表達某些毒性基因,測序質(zhì)粒 用于測序,整合質(zhì)粒 外源基因的整合,穿梭質(zhì)粒 基因克隆,表達質(zhì)粒 表達外源基因,探針質(zhì)粒 啟動子等元件的克隆篩選,4.重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體,松弛型復制,pBR322：,氯霉素可擴增,拷貝數(shù) 50 - 100 / cell,用于基因克隆,pUC18 / 19：,拷貝數(shù) 2000 - 3000 / ce

8、ll,用于基因克隆和測序,裝有多克隆位點（MCS）,正選擇顏色標記 lacZ’,pUC18 / 19：正選擇標記 lacZ’ 的顯色原理,,,pUC18/19,Plac,lacZ’,,MCS,,,b-半乳糖苷酶的a-肽段,,a,b,,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷,X-gal,藍色,pGEM-3Z：,多拷貝,裝有兩個噬菌體的強啟動子,裝有多克隆位點（MCS）,正選擇顏色標記 lacZ’,用于外源基因的高效表達,注意：T7和

9、SP6啟動子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合,2743 bp,MCS,lacZ’,PT7,ori,Apr,pGEM-3Z,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,PSP6,酶所識別，因此相應的受體菌必須表達噬菌體RNA聚合酶。如,E.coli BL21（DE3）等。,①堿溶法,i.用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體,ii.加溶菌酶裂解細菌細胞壁,iii.加NaOH和SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物

10、,iv.加高濃度的醋酸鉀溶液，沉淀染色體，去除染,色體DNA及大部分蛋白質(zhì),v.離心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白質(zhì),vi.乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒DNA,vii.用無DNase的RNase去除殘余的RNA,,,,,,,cccDNA,,L-DNA,,ocDNA,5.質(zhì)粒DNA的分離純化,② 沸水浴法,i.用含有EDTA和Triton X-100的緩沖液懸浮菌體,ii.加溶菌酶裂解細菌細胞壁,iii.沸水浴40秒鐘,iv.離心

11、，用無菌牙簽挑去沉淀物,v.乙醇或異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA,噬菌體,噬菌體是一類特異性的病毒，能高效率高特異性地侵染,宿主細胞，然后或自主復制繁殖，或整合入宿主基因組中潛,伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會相互轉(zhuǎn)化。,,,1. 大腸桿菌的 l 噬菌體DNA,l 噬菌體的生物學特性,l 噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體,l 噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成,l-DNA全長48.5kb,全基因組共36個基因,,,,,,,,,,,,,,

12、,,,,,,① 生物結(jié)構(gòu),,5’ GGGCGGCGACCT,3’,,,3’,CCCGCCGCTGGA 5’,COS,COS,,,,,,,,,cos,頭部合成基因,,,尾部合成基因,,,溶菌控制基因,,晚期控制基因,,DNA合成控制基因,,阻遏基因,,早期控制基因,,阻遏基因,,重組基因,,刪除與整合基因,,l - DNA,② 感染裂解周期,,,,,,,,,,,,E.coli,吸附,LamB受體,,,,注入,復制,包裝,裂解,,,,,,,

13、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,體內(nèi)包裝,,,,100個左右的拷貝,包裝范圍為原DNA的75 - 105%,即 36 - 51 kb,,,D,A,③ 溶原狀態(tài),l噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶原狀態(tài)。 DNA重組技術(shù)一般需要l噬菌體進入溶菌狀態(tài)。,l-DNA載體的構(gòu)建,野生型l-

14、DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當插入的外源DNA片段不大于2.5kb時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。 根據(jù)切除的多少，可將l-DNA分成兩大類載體：,插入型載體,取代型載體,① 縮短長度,,插入型載體,,,,,,,,,,體外包裝,插入位點,體外包裝,插入片段,,載體長度 37 kb,插入片段大?。?0 - 14 kb,（51 – 37）,取代型載體,,,,,,體外包裝,體外包裝,插入片段,,最小裝

15、載長度 10 kb,（51 – 26）,,,,,載體長度 26 kb,,,,插入片段,,,,,最大裝載長度 25 kb,（36 – 26）,② 刪除重復的酶切位點,野生型的l-DNA鏈上有5個EcoRI位點和7個HindIII位點，,不利于重組操作，必須刪除至1 - 2個。,同時，為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增,加一些單一的酶切位點。,③滅活某些與裂解周期有關(guān)的基因，構(gòu)建琥珀密碼子的突變體,琥珀型突變（sup)是指由CAG

16、（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。 基因工程實驗中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株。,④加裝選擇標記,野生型l-DNA上缺少合適的選擇標記。,l-DNA克隆載體上的選擇標記主要有下列兩類：,免疫功能類標記,顏色反應類標記,,加裝選擇標記：cl+,含有完整標記基,因的l-載體進入受體細胞后，建立溶原狀,態(tài)，細菌生長緩慢，形成渾濁斑

17、；當外源,DNA插入到標記基因中，基因滅活， l-重,組分子便進入溶菌循環(huán)，形成透明斑。,加裝選擇標記：lacZ’,lacZ基因編碼b-半乳糖苷酶，能催化,無色的X-gal生成藍色化合物。當外源基因,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,插入到lacZ’基因中，基因滅活，不能合成,藍色化合物；而空載體l-DNA則產(chǎn)生藍色,透明斑。,以EcoRⅠ為例,A、B、C、D、E和F片段長度分別為21.6kb、4.9kb、5

18、.5kb、7.5kb、5.9kb和3.3kb,,,,,用于建立cDNA文庫和克隆外源目的基因,,2.6kb,非必需區(qū)引入篩選標記,l-DNA重組分子的體外包裝,l-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導入受體細胞。 用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了l噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。,l-DNA及其重組分子的分離純化,① 將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期；,② 加入l噬菌體或重組

19、l噬菌體的懸浮液，37℃培養(yǎng)1小時；,③ 用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4 -12小時。這時噬菌體顆粒,密度已達1013 -1014 / L，大腸桿菌細胞已完全裂解；,④ 超速離心，沉淀噬菌體；,⑤ 苯酚抽提，釋放l-DNA ；,⑥ 乙醇或異丙醇沉淀l-DNA 。,l-DNA作為載體的優(yōu)點,① l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒。,② l-DNA載體的裝載能力為25 kb，遠遠大于質(zhì)粒的裝載量。,③ 重組l-DNA分子的篩選較為方便。,④

20、重組l-DNA分子的提取較為簡便。,2.大腸桿菌的M13單鏈噬菌體DNA,M13噬菌體的生物學特性,M13噬菌體的外型呈絲狀,M13 噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成,M13 DNA全長6407個核苷酸,M13 DNA上有10個基因,,2700個外殼蛋白分子,M13 噬菌體不裂解宿主細胞，但抑制其生長,① 生物結(jié)構(gòu),② 感染周期,,E.coli,,,基因II蛋白,基因II蛋白,基因V蛋白,M13 DNA載體的構(gòu)建,,III V

21、I I IV II X V VII IX VIII,,,野生型M13RF-DNA,,III VI I IV II X V VII IX VIII,,,,,,,M13mp系列載體,,lacZ‘,,polylinker,① 通過定點誘變技術(shù)封閉重復的重要限制性酶切口；,② 引入合適的選擇性標記基因；,④ 在MCS接頭片段的

22、兩側(cè)區(qū)域改為統(tǒng)一的DNA測序引物。,③ 加入MCS；,考斯質(zhì)粒與噬菌粒,考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建是為了提高噬菌體DNA的裝載量。,將噬菌體DNA中與包裝有關(guān)的序列與質(zhì)粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長度，同時又能保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路。,,,1.考斯質(zhì)粒（cosmid）,考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建,考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有,pHC79,6100 bp,Tcr,,,l f

23、ragment,,cos,,ori,,Apr,,PstI,,BamHI,,SalI,l-DNA cos序列和質(zhì)粒復制子的,特殊類型的載體。,1.7 kb的l-DNA片段 + pBR322片段,裝載范圍為31 - 45 kb。,考斯質(zhì)粒載體的特點,① 能像l-DNA那樣進行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細胞。,④ 裝載量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范圍。,② 能像質(zhì)粒那樣在受體細胞中自主復制。,③ 重組操作簡便，篩選容易。,⑤ 不

24、能體內(nèi)包裝，不裂解受體細胞。,pUC118 pUC18 + M13間隔區(qū) IG,pUC119 pUC19 + M13間隔區(qū) IG,500 個拷貝,3200 bp,MCS,lacZ’,lacI,ori,Apr,M13-IG,,,,,,,,,,,pUC118 / 119,,,,,,表示M13輔助噬菌體DNA,2.噬菌粒（phagemid or phasmid）,噬菌粒載體的構(gòu)建,噬菌粒是一類人工構(gòu)建的含有絲狀噬菌體間隔區(qū)（IG）,以及質(zhì)

25、粒復制子、克隆位點、標記基因的特殊類型的載體。,噬菌粒載體的特點,① 具有質(zhì)粒的基本性質(zhì)，便于外源DNA片段的克隆及重組子的篩選;,③ M13-DNA的重組分子在復制時常會發(fā)生DNA缺失，而噬菌粒重組分子則相對穩(wěn)定；,② 在一定程度上提高了外源DNA片段的裝載量；,④ 通過克隆雙鏈DNA能獲得同等長度的單一單鏈DNA。,人造染色體載體,將細菌接合因子或酵母菌染色體上的復制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn),定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當大片段

26、的外,源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，,它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩(wěn)定的復制并遺傳。,目前常用的人造染色體載體包括：,細菌人造染色體（BAC）,酵母人造染色體（YAC）,,,,1.細菌人造染色體(Bacterial Artificial Chromosomes BAC),細菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上,構(gòu)建的，其裝載量范圍在50 - 300 kb之間。,pBACs主要適用于：,克隆大型

27、基因簇（gene cluster）結(jié)構(gòu),構(gòu)建動植物基因文庫,,2.酵母人造染色體(Yeast Artificial Chromosomes YAC),YAC載體應含有下列元件：,酵母染色體的端粒序列,酵母人造染色體的構(gòu)建,pYAC4,CEN4,,,,EcoRI,URA3,,TEL,,BamHI,,TEL,,,ori,,,Apr,TRP1,,,ARS1,酵母染色體的復制子,酵母染色體的著絲粒序列,酵母系統(tǒng)的選擇標記,大腸桿菌的復制子,大腸

28、桿菌的選擇標記,YAC載體的裝載量為350 - 400 kb,,酵母人造染色體的使用,,,,,,,,,,,,,,EcoRI,EcoRI,EcoRI,BamHI,,,,,,,,,,,,,,連接,轉(zhuǎn)化酵母菌,,重組酵母染色體,2.2 DNA的體外重組,限制性核酸內(nèi)切酶,,DNA連接酶,其他用于DNA重組的工具酶,DNA切接反應的影響因素,DNA分子重組的方法,,,,,限制性核酸內(nèi)切酶,1. 限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能,識別雙鏈DNA

29、分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈,主要存在于原核細菌中，幫助細菌限制外來DNA的入侵,,,2. 限制性核酸內(nèi)切酶的類型,主要特性 I 型 II 型 III 型,蛋白結(jié)構(gòu),異源三聚體,同源二聚體,異源二聚體,切割位點,距識別序列1kb處,識別序列內(nèi)或附近,距識別序列下游,隨機性切割,特異性切割,24-26bp處,,,,限制

30、性核酸內(nèi)切酶的命名,屬名 種名 株名,H i n d III,Haemophilus influenzae d 嗜血流感桿菌d株,同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶,,3. II 型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性,識別雙鏈DNA分子中4 - 8對堿基的特定序列,大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側(cè),識別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu),5‘ … G C T G A A T T C G A G …

31、3’,3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’,,,EcoR I的識別序列,EcoR I的切割位點,II 型限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列,II 型限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式,同位酶：識別序列相同，切點不同； 同裂酶：識別位點與切割位點相同，來源不同； 同尾酶：識別位點不同，但切出的DNA片段具有相同的末端； 少數(shù)酶切割活性依賴于識別序列內(nèi)部堿基的甲基化作用。,EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端,,,,EcoRI

32、 37 ℃,,退火 4-7 ℃,5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 3’,3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’,,,,,OH,P,OH,P,II 型限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式,PstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端,,5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’,3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’,,,,,,,,,,,,,,,PstI

33、 37 ℃,5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G … 3’,3‘ … C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’,,,,,,,,,,退火 4-7 ℃,5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’,3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C

34、-T-C … 5’,,,,,OH,P,OH,P,PvuII等產(chǎn)生的平頭末端,,5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’,3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’,,,PvuII 37 ℃,4. 甲基化酶的基本特性,甲基化酶識別位點與限制性內(nèi)切酶相同，命名方法在內(nèi)切酶前加M. 一種甲基化酶在封閉一個內(nèi)切酶切口的同時，可能會產(chǎn)生另一種酶的切口； 大腸桿菌的甲基化酶有兩種，Dam和Dc

35、m； 特殊情況。例：Cla Ⅰ 5’-ATCGAT-3’,DNA連接酶,1. T4-DNA連接酶的基本性質(zhì),修復雙鏈DNA上缺刻處的磷酸二酯鍵,,T4-DNA連接酶,5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’,3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’,,,,,OH,P,OH,P,5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’,3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T

36、-C-C-T-C … 5’,nick,nick,,,修復與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上缺刻處的磷酸二酯鍵,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,連接多個平頭雙鏈DNA分子,5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’,3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’,,T4-DNA連接酶,其他用于DNA重組的工具酶,1. 大腸桿菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）,① 5‘→3‘

37、的DNA聚合酶活性,大腸桿菌DNA聚合酶 I的基本性質(zhì)：,3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’,5‘ … C-G-A-G-T-OH,,,,,,5‘ ppp dN Mg2+,,3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’,5‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH,,,,,,,,,,,DNA pol I,,,,,,5’ A G C T T C A

38、G G A T A 3’ | | | | | | | | | | |,3’ T C G A A G T C C T A G 5’,② 5‘→3‘的核酸外切酶活性,③ 3‘→5‘的核酸外切酶活性,C,切口前移標記DNA,大腸桿菌DNA聚合酶 I 的基本用途：,2. 大腸桿菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow

39、）,Klenow酶的基本性質(zhì)：,5‘→3‘的DNA聚合酶活性3‘→5‘的核酸外切酶活性,無5‘→3‘的核酸外切酶活性,① 補平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5‘粘性末端,5‘ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’,3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C … 5’,,,,,,,,,,Klenow,dATP dTTP

40、,5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’,3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’,,,,,,,,,,,,,,,,,Klenow酶的基本用途：,② DNA片段3‘末端的同位素標記,5‘ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’,3‘ … C-G-A-C

41、-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C … 5’,,,,,,,,,,Klenow,a-32P-pppdA dTTP,5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’,3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’,,,,,,,,,,,,,,,,,③ cDNA第二鏈的合成,④ 雙脫氧末端終止法

42、測定DNA序列,2.末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT）,不需要模板的DNA聚合酶，隨機摻入dNTPs,,5‘ p,,3‘ HO,OH 3‘,p 5‘,,TdT,Mg2+ dATP,,5‘ p,,3‘ HO,AAAAAAAAAAAA OH 3‘,p 5‘,,5‘ p,,3‘ HO,OH 3‘,p 5‘,,TdT,Co2+ dATP,,5‘ p,,3‘ HO AAAAAAAAAAA,AAAAAAAAAA OH 3‘,p 5

43、‘,,5‘ p,,3‘ HO,OH 3‘,p 5‘,,TdT,Co2+ dATP,,5‘ p,,3‘ HO,AAAAAAAAAAAAAA OH 3‘,p 5‘,AAAAAAAAAAA,5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T… 3’,,S1,Zn2+,5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-C T-T-G-A-G-G-A-G-T… 3’,,5‘ … G-C-T-C A-

44、G-C-T-C T-T-G-A-G G-A-G-T… 3’,,5‘ dNMPs 或 5‘ NMPs,① 內(nèi)切單鏈DNA或RNA,3. S1核酸酶,② 內(nèi)切帶缺口或缺刻的雙鏈DNA或RNA,5‘ … G-C-T-C-A-G C-T-G-G-A-G-T… 3’,3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5‘,,,,,,,,,,,,,5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’,

45、3‘ … C-G-A-G-T-C A-C-C-T-C-A… 5‘,,,,,,,,,,,,,nick,,gap,,,S1,Zn2+,5‘ … G-C-T-C-A-G,3‘ … C-G-A-G-T-C,,,,,,,T-G-G-A-G-T… 3’,A-C-C-T-C-A… 5‘,,,,,,,特征：,降解單鏈DNA或RNA，包括不能形成雙鏈的區(qū)域，降解DNA的速度大于降解RNA的速度； 降解反應的方式為內(nèi)切或外切； 酶量過大時會伴有

46、雙鏈核酸的降解； S1核酸酶常用來切平突出的單鏈末端及制作S1圖譜。,4. 單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶,,,Ca2+,5‘ dNMPs 或 5‘ NMPs,ssDNA or RNA,,,,,Ca2+,雙鏈3‘端外切活性，伴有單鏈內(nèi)切活性,,,Bal31,Bal31,Ca2+,Bal31,,,,+,,,可控性地截短DNA分子,5.T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）,催化ATP的g-磷酸基團轉(zhuǎn)移至DNA或RNA的5

47、‘ 末端,,5‘ HO,,3‘ HO,OH 3‘,OH 5‘,,T4-PNP,Mg2+ pppATP（g-32P-ATP）,,5‘ p,,3‘ HO,OH 3‘,p 5‘,核酸雜交探針分子的同位素標記,磷酸激酶的交換反應,6.堿性磷酸單酯酶,來自小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP）,來自大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（BAP）,,5‘ p,OH 3‘,DNA or RNA,5‘ ppp dN,5‘ pppN,,BAP / CIP,,

48、OH 3‘,5‘ HO,5‘ HO dN,5‘ HO N,催化DNA、RNA 5‘ 端除磷反應,去除載體或外源片段5’端的磷酸基團,7. T4-DNA聚合酶,T4-DNA酶的基本特性：,在無dNTP時，可以從任何3‘-OH端外切,在四種dNTP均存在時，聚合活性占主導地位,5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性,5‘,3‘,3‘,5‘,T4-DNA聚合酶的基本用途：,5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH

49、 P-G-G-A-G … 3’,3‘ … C-G-A-G-P HO-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’,,,,,,,,,,T4-DNA聚合酶,5‘ … G-C-T-C- OH P-G-G-A-G … 3’,3‘ … C-G-A-G-P HO -C-C-T-C … 5’,,,,,,,,,① 切平由

50、核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3’粘性末端,② DNA片段3‘末端的同位素標記,5‘ G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3’,3‘ C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5‘,,,,,,Mg2+ 5‘ ppp dN 5‘ ppp dA（a-32P-dATP）,,,,,,,,,,,5‘ G-C-T-C-A-G-C-T-G-OH,HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5‘,,,,,,T4-DNA pol,T4

51、-DNA pol,5‘ G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3’,3‘ C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5‘,,,,,,,,,,,,,,1. II 型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應的操作,大部分II 型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應條件：,Tris-HCl,50 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,NaCl,50 - 150 mM,DTT,1 mM,50 mM 低鹽酶,100 mM 中鹽酶,150

52、 mM 高鹽酶,,Volume,20 - 100 ml,T T,37 ℃ 1 - 1.5 hr,1 U 核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最佳反應條件下反應 1 小時，完全,水解 1 mg pBR322 DNA所需的酶量。,DNA切接反應的影響因素,,,II 型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：,對鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時酶切，但應注意：,5‘ …GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’,3‘ …CGATGTACCTAGGGCCC

53、AAGCGTA…5’,,,BamHI SmaI,5‘ …GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT…3’,3‘ …CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA…5’,5‘ …GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT…3’,3‘ …CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA…5’,,對鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法

54、：,① 使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時酶解。,② 低鹽酶先切，然后補加鹽，高鹽酶再切；,③ 一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切,i. 0.1倍體積的 5 M NaAc pH 5.4,ii. 2倍體積的冰冷乙醇,iii. 冰浴 5 分鐘、高速冷凍離心10分鐘、干燥,限制性核酸內(nèi)切酶的星號活性,高濃度的甘油、低離子強度、極端pH值等，會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的Star activity現(xiàn)象。

55、 EcoRⅠ BamHⅠ,2. DNA連接酶的反應條件,Tris-HCl,50 - 100 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,ATP,0.5 - 1 mM,DTT,5 mM,Volume,10 - 20 ml,T T,4 - 15 ℃ 4 - 16 hr,1 U DNA連接酶的酶活性：在最佳反應條件下15 ℃反應 1 小時，,完全連接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量。,連接溫度與時間常用下列組合：

56、15 ℃ -2h; 12 ℃ -8h；7 ℃過夜。,重組率及其影響因素,1.重組率的定義,重組率 = 含有外源DNA的重組分子數(shù) / 載體分子總數(shù)在常規(guī)實驗條件下，重組率一般為25 - 75% 重組率是衡量連接反應效率的重要指標，較高的重組率可以大大簡化DNA重組的后續(xù)操作。,,,2.提高重組率的方法,① 提高外源DNA片段與載體的分子比：2 : 1 - 10 : 1,② 載體DNA分子在連接前先除去磷酸基團：,5',

57、5',,EcoRI,,,5',G,CTTAA p,AATTC,G,5' p,5',,5',AATTC,G,5' HO,,,退火,5',G-A-A-T-T-C,C-T-T-A-A G,,5',,G A-A-T-T-C,C-T-T-A-A-G,,,,,OH,HO,OH,HO,堿性磷酸單酯酶,堿性磷酸單酯酶,T4-DNA ligase,③ 加裝同聚尾末端：,CTGCA 3

58、9;,G,G,3' ACGTC,5',GCATG 3',C,,5',C,3' GTACG,,,T4-DNA ligase,,,TdT,TdT,dCTP,dGTP,GCATGCCCCCC 3',C,,退火,C,3' CCCCCCGTACG,,CTGCAGGGGGG 3',G,G,3' GGGGGGACGTC,5',,5',,CTGCAGGGG

59、GG C,G CCCCCCGTACG,,5',,5',,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,Klenow,同種內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘性末端的連接,5',5',,EcoRI,,,,退火,G,CTTAA,AATTC,G,G,CTTAA,AATTC,G,,,,T4-DNA ligase,5',,5',,,,5',,5',,,,DNA分子重組的方

60、法,同尾酶產(chǎn)生的粘性末端的連接,BamHI,,5',G,CCTAG,GATCC,G,5',5',,5',GATCA,T,5',,,退火,G,CCTAG,GATCC,G,5',GATCA,T,,,T4-DNA ligase,5',,5',,BclI,,G,CCTAG,GATCC,G,,,5',GATCA,T,,,,5',,5',,,,平頭末端的連接,,

61、,增加連接酶用量，通常為黏性末端連接用量的10倍； 增加DNA平頭末端的濃度； 加入NaCl或LiCl以及PEG； 適當提高連接反應溫度； ATP濃度。,不同粘性末端的連接,BamHI,,5',G,CCTAG,GATCC,G,5',5',,5',G,ACGTC,3',,,,T4-DNA ligase,5',,5',,PstI,,3',,T4-DNA pol,切平,5

62、',,5',G,C,,Klenow,補平,5',GGATC,CCTAG,GATCC,5',CTAGG,,5',,5',,,,,5’ Klenow補3’ T4切,人工粘性末端的連接,5',G,CCTAG,GATCC,G,5',5',,5',5' AATTC,G,,,,T4-DNA ligase,5',,5',,,Klenow,補平,K

63、lenow,補平,5',GGATC,CCTAG,GATCC,5',CTAGG,5',GAATT,CTTAA 5',,5',5' AATTC,TTAAG,,,,TdT,TdT,dGTP,dCTP,GAATTCCCCCC,CTTAA,,AATTC,CCCCCCTTAAG,,GGATCGGGGGG,CCTAG,GATCC,GGGGGGCTAGG,GGATCGGGGGGAATTC,CCTAGCC

64、CCCCTTAAG,退火,,,BamH I,BamH I,EcoR I,BamH I,,,5‘突出末端,3‘突出末端,CTGCA 3',G,G,3' ACGTC,5',GCATG 3',C,,5',C,3' GTACG,,,T4-DNA ligase,,,TdT,TdT,dCTP,dGTP,GCATGCCCCCC 3',C,,退火,,Pst I,Pst I,C,3'

65、 CCCCCCGTACG,,CTGCAGGGGGG 3',G,G,3' GGGGGGACGTC,5',,5',,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,,,5',,5',,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,,5',,5',,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,,,,5'

66、,,5',,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,Klenow,Pst I,Sph I,平頭末端,C 3',G,G,5',G 3',C,,5',C,3' G,,,T4-DNA ligase,,,TdT,TdT,dTTP,dATP,GTTTTTTTTTT 3',C,,退火,C,3' TTTTTTTTTTG,,CAAAAAAAAAA

67、3',G,G,3' AAAAAAAAAAC,5',,5',,CAAAAAAAAAAC,GTTTTTTTTTTG,,S1,C,3',,5',,5',,CAAAAAAAAAAC,GTTTTTTTTTTG,加熱,,,,,酶切位點的定點更換,BamHI,,5',5',,,,T4-DNA ligase,,Klenow,補平,GATCC,5',,G,5',G,C

68、CTAG,,5',5',5',GGATC,CCTAG,,5',GATCC,CTAGG,,5',5',GGATCCCAATTGGGATCC,CCTAGGGTTAACCCTAGG,,5',,5',,EcoR I,CCAATTGG,GGTTAACC,,EcoR I linker,,,引入酶切位點 在原有酶切位點旁邊引入另一個酶切位點 更換酶切位點,C 用于基因轉(zhuǎn)移的受體

69、菌或細胞,各種基因工程受體的特性,,實驗室常用的基因工程受體,,受體細胞應具備的條件,,受體細胞應具備的條件,① 限制缺陷型,② 重組整合缺陷型,③ 具有較高的轉(zhuǎn)化效率,④ 具有與載體選擇標記互補的表型,⑤ 感染寄生缺陷型,,,各種基因工程受體的特性,1.大腸桿菌,遺傳背景清楚，載體受體系統(tǒng)完備，生長迅速，培養(yǎng)簡單，重組子穩(wěn)定。,,,,2.枯草桿菌,遺傳背景清楚，蛋白質(zhì)分泌機制健全，生長迅速，培養(yǎng)簡單。但遺傳欠穩(wěn)定，載體受體系統(tǒng)欠完備。

70、,3.鏈霉菌,抗生素的主要生產(chǎn)者，分子操作相對簡便。但遺傳不穩(wěn)定，生長相對緩慢。,4.酵母菌,具有真核生物的特征，遺傳背景清楚，生長迅速，培養(yǎng)簡單，外源基因表達系統(tǒng)完善，遺傳穩(wěn)定，但內(nèi)源性蛋白產(chǎn)物種類繁多且含量高。,,5.昆蟲細胞（家蠶）,具有真核生物特征，外源基因表達量高，繁殖較快，培養(yǎng)成本低廉，遺傳穩(wěn)定，但DNA重組操作系統(tǒng)欠完善。,6.哺乳動物細胞（中國倉鼠卵巢細胞 CHO）,與人的親緣關(guān)系近，分子重組表達系統(tǒng)健全，具有合適的糖基