重組dna藥物藥學(xué)專業(yè)

1、重組DNA藥物Recombinant DNA Drugs,三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院 盛 德 喬shengdq@ctgu.edu.cnQQ:834309103,,重組DNA藥物：應(yīng)用重組DNA技術(shù)（包括基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)）制造的基因重組多肽、蛋白質(zhì)類治療劑。重組基因的表達(dá)？,克隆基因的表達(dá),表達(dá)載體的構(gòu)建 受體細(xì)胞的建立 表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,,表達(dá)體系包括：表達(dá)載體原核表達(dá)載體真核表達(dá)載體宿主細(xì)胞大腸桿菌

2、、芽孢桿菌、鏈霉菌（原核）酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞（真核）,1. 原核表達(dá)體系 (E.coli 表達(dá)體系),標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志多接頭克隆位點(diǎn)強(qiáng)啟動(dòng)子 翻譯調(diào)控序列 E.coli表達(dá)體系的不足：不宜表達(dá)真核基因組DNA；不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)；表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體(inclusion body) ；很難表達(dá)大量可溶性蛋白。,大腸桿菌表達(dá)載體的結(jié)構(gòu),除了含有與克隆載體相同的元件之外，還必須

3、含有表達(dá)載體所需要的其它元件:啟動(dòng)子是DNA鏈上能與RNA聚合酶結(jié)合并起始mRNA合成的序列大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)常用的啟動(dòng)子有：lacZ啟動(dòng)子 強(qiáng)啟動(dòng)子,核糖體結(jié)合位點(diǎn)SD序列（Shine-Dalgarno sequence）--mRNA中用于結(jié)合原核生物核糖體的序列。SD序列與AUG之間的距離也會(huì)影響翻譯效率，一般以5～13個(gè)堿基為宜表達(dá)載體都含有相應(yīng)的SD序列及適當(dāng)長(zhǎng)度的SD-ATG間隔距離,,終止子基因或操縱子3

4、′的一段核苷酸序列在表達(dá)載體中多放在多克隆位點(diǎn)的下游,表達(dá)載體,,,,常用的大腸桿菌表達(dá)載體,非融合蛋白表達(dá)載體表達(dá)的蛋白與天然狀態(tài)下存在的蛋白在結(jié)構(gòu)、功能、免疫原性方面基本一致。融合蛋白表達(dá)載體 融合蛋白（fusion protein）－表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽的N末端由原核DNA編碼，C末端由克隆的真核DNA編碼。,,這類載體SD-ATG間隔已固定，翻譯起始信號(hào)組織合理，其表達(dá)的蛋白在其N-端或C-端常融合有一段細(xì)菌的多

5、肽或蛋白質(zhì)。pGEX序列載體 （Pharmacia公司）GST系統(tǒng)b-半乳糖苷酶系統(tǒng)麥芽糖結(jié)合蛋白系統(tǒng)蛋白A系統(tǒng) IgG-Sepharose,表達(dá)標(biāo)簽 tag,常用的標(biāo)簽有：GST-谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，glutathione-S-transferase）多肽 ，凝血酶（Thrombin）水解蛋白去掉GST標(biāo)簽 FLAG-DYKDDDDK，專門設(shè)計(jì)用于融合蛋白質(zhì)的免疫吸附純化 HA (influenza he

6、magglutinin epitope-YPYDVPDYA)流感血凝素抗原決定簇 His-C末端、N末端、或內(nèi)部帶有6×His標(biāo)簽(His-tagged)的融合蛋白 c-myc (EQKLISEEDL)方便蛋白的鑒定和純化！,GST 純化系統(tǒng),大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),優(yōu)點(diǎn)：遺傳背景清楚用大腸桿菌進(jìn)行遺傳操作的方法非常完善生長(zhǎng)繁殖周期短,表達(dá)中的問題,缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制，只能表達(dá)cDNA;缺乏翻譯后加工機(jī)制，不能折疊和

7、糖基化;融合蛋白形成包涵體（inclusion body），復(fù)性后才有活性;很難表達(dá)大量的可溶性蛋白。,為什么建立真核表達(dá)系統(tǒng)？,原核表達(dá)系統(tǒng)的缺陷：不能對(duì)表達(dá)的真核蛋白進(jìn)行正確的折疊和翻譯后加工!!!哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),2. 真核表達(dá)體系,真核細(xì)胞：酵母、昆蟲、哺乳類動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA 可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì) 表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累 缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí),真核表達(dá)載體,真核

8、表達(dá)載體的功能元件原核DNA序列啟動(dòng)子增強(qiáng)子剪接信號(hào)終止信號(hào)和加poly(A）信號(hào)篩選標(biāo)記新霉素抗性基因 neor 胸苷激酶基因tk,真核表達(dá)載體的種類,質(zhì)粒型載體pcDNA系列 Invitrogen公司產(chǎn)品pCMV-HA Clontech公司產(chǎn)品病毒型載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體腺病毒載體昆蟲桿裝病毒載體,表達(dá)載體pcDNA4的物理圖譜,,轉(zhuǎn)染 —— 將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程方法

9、：磷酸鈣轉(zhuǎn)染 DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 （Lipofectamine invitrogen 公司產(chǎn)品,實(shí)驗(yàn)室常用） 顯微注射 轉(zhuǎn)染（病毒載體）,外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)方式,依表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)短瞬時(shí)表達(dá)（一過性表達(dá)） 不整合穩(wěn)定表達(dá) 篩選表達(dá)方式分泌表達(dá)，非分泌表達(dá)融合表達(dá)，非融合表達(dá),瞬間表達(dá)Transient expression :外源基因不整合到宿主染色體中，不能復(fù)制

10、，在細(xì)胞中的表達(dá)時(shí)間較短(2-3天)，轉(zhuǎn)染的方法相對(duì)簡(jiǎn)單，耗時(shí)較少，適用快速分析.穩(wěn)定表達(dá)Stable expression :外源基因整合到宿主染色體,需要篩選，可獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，可復(fù)制，并可以穩(wěn)定傳代，耗時(shí)長(zhǎng)，不易成功.,,哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系,CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) ：CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)能準(zhǔn)確進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后重組蛋白的加工修飾，表達(dá)的糖基化蛋白在分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性方面與天然蛋白十分接近。 CHO細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞，很少分泌自身的內(nèi)

11、源蛋白，而表達(dá)的外源產(chǎn)物是胞外分泌的，這樣便于產(chǎn)物的下游分離純化；在CHO細(xì)胞內(nèi)重組基因能高效擴(kuò)增和表達(dá)；CHO細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，且具有較高的耐受剪切和滲透壓能力，可以進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。幼倉(cāng)鼠腎（BHK）細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),,哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系優(yōu)點(diǎn)：一是哺乳動(dòng)物細(xì)胞能夠表達(dá)人或哺乳動(dòng)物的蛋白質(zhì)；二是哺乳動(dòng)物細(xì)胞可對(duì)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行正確折疊、組裝和糖基化等加工，生產(chǎn)有生物活性的產(chǎn)品。,,真核基因表達(dá)應(yīng)注意的問題：載體必須是表達(dá)載體目的基因不

12、能有內(nèi)含子克隆過程中不能改變其ORF,,基因工程蛋白質(zhì)類藥物,細(xì)胞因子是指機(jī)體細(xì)胞合成和分泌的小分子多肽類因子，它們具有調(diào)節(jié)機(jī)體的生理功能和免疫功能，因而有可能利用基因工程技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)，用于治療腫瘤、感染、免疫低下、造血功能障礙等疾病。目前已研制成功或正在研制的基因工程細(xì)胞因子類藥物主要有促紅細(xì)胞生成素(EPO)、集落刺激因子(CF)、干擾素（IFN）、白細(xì)胞介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、趨化因子、生長(zhǎng)因子（GF）和凝血因子（

13、F）等。,基因工程細(xì)胞因子類藥物,基因重組人促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin,EPO）,EPO是一種主要由腎臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等部位合成分泌的多功能糖蛋白激素, 是作用于紅系祖細(xì)胞的造血生長(zhǎng)因子，對(duì)神經(jīng)元的許多功能也具有重要的調(diào)控作用。 EPO是最早發(fā)現(xiàn)并首先運(yùn)用于臨床的造血生長(zhǎng)因子， 1985年成功表達(dá)了重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)。rhEPO成為當(dāng)前研究開發(fā)最成功的基因工程藥物。,促細(xì)胞生成素的生物學(xué)作用,EPO

14、主要通過促進(jìn)骨髓中紅系祖細(xì)胞的存活、增殖和分化以調(diào)控紅細(xì)胞的生成。促進(jìn)系祖細(xì)胞的增殖、分化和成熟調(diào)控神經(jīng)元部分功能對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度也有明顯的調(diào)節(jié)作用,人促紅細(xì)胞生成素基因重組,天然的 hEPO制品一般是從貧血病患者尿中提取的，所以藥源極為匱乏，不能滿足需要。因此，在20世紀(jì)80年代就開始rhEPO的研究，從胎兒肝中克隆出 hEPO基因, 并研制成功 rhEPO。1985年美國(guó)FDA 批準(zhǔn)rhEPO作為治療腎性貧血的藥物。研制rhE

15、PO的主要環(huán)節(jié)包括: 獲得人促紅細(xì)胞生成素基因和建立重組人促紅細(xì)胞生成素的有效表達(dá)系統(tǒng)等。,hEPO基因由5個(gè)外顯子（共582bp）和4個(gè)內(nèi)含子（共1562bp）組成。外顯子共編碼193個(gè)氨基酸，包括組成信號(hào)肽的27個(gè)氨基酸。經(jīng)人促紅細(xì)胞生成素cDNA的克隆及其核苷酸序列的測(cè)定。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增EPO基因：人胎肝中提取總mRNA →RT-PCR技術(shù)克隆hEPO基因。(cDNA)將cDNA插入真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)。,

16、重組人促紅細(xì)胞生成素的表達(dá)系統(tǒng),為了獲得分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性與天然 EPO相似的rhEPO，選用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、非洲綠猴腎細(xì)胞COS7表達(dá)系統(tǒng)、幼倉(cāng)鼠腎（BHK）細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。目前國(guó)內(nèi)外首選CHO 細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)用來表達(dá)生產(chǎn)rhEPO。昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、乳腺表達(dá)系統(tǒng),促紅細(xì)胞生成素臨床應(yīng)用,腎功能衰竭所致的貧血：這種病只有靠連續(xù)輸血維持生命，但輸血又使病人面臨病毒感染和血過量的危險(xiǎn)。EPO有刺

17、激紅細(xì)胞生成，免去慢性腎衰竭病人的輸血。癌性貧血：腫瘤引起的貧血或接受化療、放療所引起的貧血。 結(jié)締組織病貧血：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和紅斑狼瘡所致的貧血。骨髓增生異常綜合征貧血：促進(jìn)骨髓造血狀況改善。,基因工程肽類激素藥物,肽類激素是由內(nèi)分泌腺或內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的生物活性物質(zhì)，經(jīng)血液循環(huán)，局部彌散到相應(yīng)的組織和細(xì)胞與受體特異結(jié)合發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用，參與機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖等多種生命活動(dòng)過程。人生長(zhǎng)激素、重組人胰島素、重組人降鈣素、重

18、組人胰高血糖素和重組人胰高血糖素樣肽-1,重組合成胰島素,胰島素與糖尿?。阂葝u素的發(fā)現(xiàn)對(duì)改變糖尿病患者的命運(yùn)及揭示糖尿病的病因及相關(guān)影響因素意義重大。,胰島素的結(jié)構(gòu),人胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)胰島素的兩個(gè)肽鏈分別為21個(gè)氨基酸組成的A鏈和30個(gè)氨基酸組成的B鏈，氨基酸排列有種屬差異。,胰島素的合成方法,方法一：分別合成A鏈和B鏈法 1 9 7 8 年，美國(guó)國(guó)立醫(yī)學(xué)中心的有關(guān)專家用基因重組法進(jìn)行人胰島素的合成，即讓大腸桿菌分別產(chǎn)生

19、胰島素的A鏈和B鏈，再用化學(xué)方法將兩者連結(jié)起來。,方法二：通過合成人胰島素原的方法,即先合成人胰島素的前體，即胰島素原，再用酶切除C肽而制備人胰島素。,影響分離純化的主要因素產(chǎn)物活性、純度和雜質(zhì)產(chǎn)物表達(dá)形式和表達(dá)水平產(chǎn)物本身的分子特性產(chǎn)物的用途和需求量,基因工程藥物的分離純化,基因工程藥物的質(zhì)量控制,與傳統(tǒng)藥品生產(chǎn)的區(qū)別利用活細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，產(chǎn)品為蛋白質(zhì)，具有復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)． 產(chǎn)品的制備過程中，藥物容易發(fā)生變化． 參與人

20、體的生理調(diào)節(jié)作用，極微量就可產(chǎn)生顯著效應(yīng)，在性質(zhì)或劑量上不能有任何偏差．因此，必需要嚴(yán)格控制藥品質(zhì)量，確保產(chǎn)品安全有效。,分泌量極低而生理藥理活性極高具有細(xì)胞和組織特異性多數(shù)細(xì)胞因子具有多功能性細(xì)胞因子間存在復(fù)雜的相互作用具有低免疫原性,,基因工程藥物的特點(diǎn),基因工程藥物的質(zhì)量要求,提供表達(dá)體系及工程菌的詳細(xì)資料。提供培養(yǎng)方法，純化方法、除去微量雜質(zhì)的方法等。要求進(jìn)行理化鑒定，包括產(chǎn)品的特征、純度及與天然產(chǎn)品的一致性。要

21、求進(jìn)行外源核酸和抗原檢測(cè)與天然產(chǎn)品進(jìn)行生物活性或效力試驗(yàn)的比較進(jìn)行動(dòng)物毒性試驗(yàn)要有足夠的對(duì)人體的安全性資料必須經(jīng)過臨床試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)其安全性和有效性。,1)原材料的控制：　　　表達(dá)載體和宿主細(xì)胞　　　克隆基因的序列2)生產(chǎn)的控制：　　　原始細(xì)胞庫(kù)　　　有限代次的生產(chǎn)　　　連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)　　　分離純化,,,基因工程藥物的質(zhì)控要點(diǎn),目的蛋白質(zhì)的含量測(cè)定,產(chǎn)物雜質(zhì)檢測(cè),宿主細(xì)胞蛋白、病素和細(xì)菌等微生物、熱原質(zhì)、內(nèi)毒素、致敏原

22、及DNA等,,終產(chǎn)品的質(zhì)量控制,產(chǎn)品的鑒定：方法：電泳法、免疫學(xué)分析法、受體結(jié)合試驗(yàn)和高效液相色譜法等內(nèi)容：氨基酸成分分析、肽圖分析、蛋白質(zhì)濃度及分子量測(cè)定、蛋白質(zhì)二硫鍵分析純度分析,生物活性測(cè)定：,安全性評(píng)價(jià)：,穩(wěn)定性考察：,產(chǎn)品一致性的保證：,體內(nèi)生物活性測(cè)定：根據(jù)目的基因產(chǎn)物的 生物學(xué)特性，建立適合的生物學(xué)模型體外生物活性測(cè)定：細(xì)胞培養(yǎng)計(jì)數(shù)法等,除一般安全性要求外，還要根據(jù)基因工程產(chǎn)品本身的結(jié)構(gòu)特性，進(jìn)行某些

23、藥物動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)研究。,對(duì)純度、分子特征和生物學(xué)效價(jià)等多方面進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),幾種常見基因重組藥物,重組人胰島素（rh-Insulin）本品是最早上市（1982年）的基因重組藥物。我國(guó)以大腸菌或酵母菌為工程菌的生產(chǎn)也已獲得成功。本品減少了動(dòng)物胰島素的過敏反應(yīng)。重組人生長(zhǎng)激素（rh-GH）促進(jìn)長(zhǎng)骨的軟骨生長(zhǎng)區(qū)而增加長(zhǎng)度，增加肌細(xì)胞數(shù)目和體積等作用而促進(jìn)生長(zhǎng)。,,重組人干擾素（rh-IFNs） 調(diào)節(jié)機(jī)體免疫防御功能，增加NK細(xì)胞、TC

24、細(xì)胞殺傷力；增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬活動(dòng)；直接抑制及殺傷腫瘤細(xì)胞。具有抗病毒、抗腫瘤的效應(yīng)。重組人白細(xì)胞介素-2（rh-IL-2） 促進(jìn)T細(xì)胞、NK細(xì)胞增殖，增強(qiáng)其殺傷活性；促進(jìn)Β細(xì)胞增殖及分泌免疫球蛋白；促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNF，增強(qiáng)其殺傷活性；誘導(dǎo)產(chǎn)生LAK及TIL細(xì)胞。用于腎癌、黑色素瘤、膀胱癌、結(jié)腸癌、肺癌以及非何杰金氏淋巴瘤、癌性胸腔積液等腫瘤疾病的治療。,,重組人腫瘤壞死因子（rh-TNF） 直接殺傷腫瘤作用最強(qiáng)的生物活性因子，