重組dna導入受體細胞

1、重組DNA導入受體細胞,,1、轉(zhuǎn)化概念轉(zhuǎn)化 ：DNA 重組分子在體外構(gòu)建完成后，必須導入特定的受體細胞，使之無性繁殖并高效表達外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個導入過程及操作統(tǒng)稱為重組 DNA 分子的轉(zhuǎn)化（Transformation）。重組DNA 人工導入受體細胞有許多方法，包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、接合以及其它物理手段，如受體細胞的電穿孔和顯微注射等，這些導入方法在 DNA 重組技術(shù)中統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)化操作。,一、重組DNA轉(zhuǎn)化,感受態(tài)：受體細胞

2、最易接受外源 DNA 片段而實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種特殊生理狀態(tài)。處于感受態(tài)的受體細菌，其吸收轉(zhuǎn)化因子的能力為一般細菌生理狀態(tài)的千倍以上，而且不同細菌間的感受態(tài)差異往往受自身的遺傳特性、菌齡、生理培養(yǎng)條件等諸多因素的影響。,2、細菌轉(zhuǎn)化的步驟：感受態(tài)的形成。感受態(tài)時細胞表面出現(xiàn)各種蛋白質(zhì)和酶類，負責轉(zhuǎn)化因子的結(jié)合、切割及加工。感受態(tài)細胞能分泌一種小分子量的激活蛋白或感受因子，其功能是與細胞表面受體結(jié)合，誘導某些與感受態(tài)有關(guān)的特征性蛋白質(zhì)（如細菌

3、溶素）的合成，使細菌胞壁部分溶解，局部暴露出細胞膜上的 DNA 結(jié)合蛋白和核酸酶等。轉(zhuǎn)化因子的結(jié)合。受體菌細胞膜上的DNA結(jié)合蛋白可與轉(zhuǎn)化因子的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，單鏈DNA或RNA雙鏈RNA以及DNA/RNA雜合雙鏈都不能結(jié)合在膜上。,轉(zhuǎn)化因子的吸收。雙鏈 DNA 分子與結(jié)合蛋白作用后，激活鄰近的核酸酶，一條鏈被降解，而另一條鏈則被吸收到受體菌中。整合復合物前體的形成。進入受體細胞的單鏈 DNA 與另一種游離的蛋白因子結(jié)合，

4、形成整合復合物前體結(jié)構(gòu)，它能有效地保護單鏈DNA免受各種胞內(nèi)核酸酶的降解，并將其引導至受體菌染色體DNA處。轉(zhuǎn)化因子單鏈DNA的整合。供體單鏈DNA片段通過同源重組，置換受體染色體DNA的同源區(qū)域，形成異源雜合雙鏈 DNA結(jié)構(gòu)。,二、受體細胞,受體細胞(receptor cell)：又稱為宿主細胞 (host cell)，是指能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細胞感受態(tài)(competence)：是指細菌吸收外源DNA的生理狀態(tài)。

5、感受態(tài)細胞(competence cell)：是指具有接受外源DNA能力的細胞。,1、原核生物細胞的優(yōu)點,大部分原核生物細胞沒有纖維素組成的堅硬細胞壁，便于外源DNA的進入。沒有核膜，染色體DNA沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)，這為外源DNA與裸露的染色體DNA重組減少了麻煩基因組簡單，不含線粒體和質(zhì)體基因組，便于對引入的外源基因進行遺傳分析。原核生物多數(shù)為單細胞生物，容易獲得一致性的實驗材料，并且培養(yǎng)簡單，繁殖迅速，實驗周期短

6、，重復實驗快。,原核生物細胞不具備真核生物的蛋白質(zhì)折疊復性系統(tǒng)，即使許多真核生物基因得以表達，得到的也多是無特異性空間結(jié)構(gòu)的多肽鏈。原核生物細胞缺乏真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，而許多真核生物蛋白質(zhì)的生物活性正是依賴于其側(cè)鏈的糖基化或磷酸化等修飾作用。原核生物細胞內(nèi)源性蛋白酶易降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白，造成表達產(chǎn)物不穩(wěn)定等。,2、原核生物細胞表達真核生物基因存在的缺點：,3、被用作受體菌的原核生物：大腸桿菌、枯草桿菌、藍

7、細菌等。大腸桿菌受體細胞大腸桿菌屬革蘭氏陰性菌，它是目前為止研究得最為詳盡、應(yīng)用最為廣泛的原核生物種類之一，也是基因工程研究和應(yīng)用中發(fā)展最為完善和成熟的載體受體系統(tǒng)。優(yōu)點：繁殖迅速、培養(yǎng)簡便，代謝易于控制。缺點：大腸桿菌細胞間隙中含有大量的內(nèi)毒素可導致人體熱原反應(yīng)。,枯草桿菌受體細胞枯草桿菌又稱枯草芽孢桿菌，是一類革蘭氏陽性菌。優(yōu)點：枯草桿菌具有胞外酶分泌－調(diào)節(jié)基因，能將具有表達的產(chǎn)物高效分泌到培養(yǎng)基中，大大簡化

8、了蛋白表達產(chǎn)物的提取和加工處理等，而且在大多數(shù)情況下，真核生物的異源重組蛋白經(jīng)枯草桿菌分泌后便具有天然的構(gòu)象和生物活性?？莶輻U菌不產(chǎn)生內(nèi)毒素，無致病性，是一種安全的基因工程菌?？莶輻U菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培養(yǎng)?？莶輻U菌也具有大腸桿菌生長迅速、代謝易于調(diào)控、分子遺傳學背景清楚等優(yōu)點。應(yīng)用：已成功的用于表達人的β干擾素、白細胞介素乙型肝炎病毒核心抗原和動物口蹄疫病毒VPI抗原等。,藍細菌（藍藻）藍藻——又稱藍綠

9、藻或藍細菌，它含有葉綠素a(缺乏葉綠素b)和藻膽素，具有光合系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ) 和光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)、能進行光合作用，但它又具有細菌的特征，無細胞核及雙層膜結(jié)構(gòu)的細胞器，染色體裸露，是一種典型的原核生物。藍藻作為表達外源基因的受體菌兼具微生物和植物的優(yōu)點，具體表現(xiàn)在：基因組為原核型，除了裸露的染色體DNA外，不含葉綠體DNA和線粒體DNA，遺傳背景簡單，便于基因操作和外源DNA的檢測。,細胞壁屬G-，主要由肽聚糖組成，

10、便于外源DNA的轉(zhuǎn)化。營光合自養(yǎng)生長，培養(yǎng)條件簡單，只需光、CO2、無機鹽、水和適宜的溫度就能滿足生長需要。多種藍藻含內(nèi)源質(zhì)粒，為構(gòu)建藍藻質(zhì)粒載體提供了極好的條件。藍藻富含蛋白質(zhì)，并且多數(shù)藍藻無毒，早已用作食物或保健品，在此基礎(chǔ)上采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，把一些重要藥物的基因轉(zhuǎn)入無毒藍藻，就可達到錦上添花的效果。,4、真核生物細胞,真菌受體細胞真菌是低等的真核生物，其基因結(jié)構(gòu)、表達調(diào)控機制以及蛋白質(zhì)的加工與分泌都具有真核生物的特征，因此利

11、用真菌細胞表達高等動植物基因具有原核生物細胞無法比擬的優(yōu)點。,酵母菌,酵母菌作為外源真核基因表達系統(tǒng)的優(yōu)點酵母菌是結(jié)構(gòu)最為簡單的真核生物之一,其基因表達調(diào)控機理比較清楚,遺傳操作相對較為簡單。具有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)。不含有特異性的病毒，不產(chǎn)生毒素，有些酵母菌屬(如釀酒酵母)在儀器工業(yè)中有著幾百年的應(yīng)用歷史，屬于安全型基因工程受體系統(tǒng)。培養(yǎng)簡單，利于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，成本低廉。能將外源基因表達產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中，便于產(chǎn)

12、物的提取和加工等。,動物細胞,常用的動物受體細胞有Hela細胞、猴腎細胞和中國倉鼠巢細胞(CHO)等。哺乳動物細胞作為受體細胞的優(yōu)點是：能識別和除去外源真核基因中的內(nèi)含子，剪接加工成成熟的RNA。真核基因表達蛋白在翻譯后能被正確加工或修飾,產(chǎn)物具有較好的蛋白質(zhì)免疫原性,約為酵母細胞16-20倍。,易被重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,具有遺傳穩(wěn)定性和可重復性。經(jīng)轉(zhuǎn)化的動物細胞可將表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，便于提純和加工，成本低。缺

13、點是:組織培養(yǎng)技術(shù)要求高，如培養(yǎng)和篩選一個高度擴增的轉(zhuǎn)化子CHO細胞，通常需要數(shù)月之久,難度較大。,目前用作基因轉(zhuǎn)移的受體動物主要有豬，羊、牛、魚等經(jīng)濟動物和鼠、猴等實驗動物，主要用途在于大規(guī)模表達生產(chǎn)天然狀態(tài)的復雜蛋白質(zhì)或動物疫苗、動物品種的遺傳改良及人類疾病的基因治療等。常用的動物受體細胞有小鼠L細胞、Hele細胞猴腎細胞和中國倉鼠卵巢細胞(CHO)等。以動物細胞，尤其是哺乳動物細胞作為受體細胞的優(yōu)點,植物受體細胞

14、優(yōu)點：全能性，即一個分離的活細胞在合適的培養(yǎng)條件下，較容易再分化成植株，這意味著一個獲得外源基因的體細胞可以培養(yǎng)出能穩(wěn)定遺傳的植株或品系。 缺點：植物細胞有纖維素參與組成的堅硬細胞壁，不利于攝取重組DNA分子?，F(xiàn)在用作轉(zhuǎn)基因受體的植物有水稻、棉花、玉米、馬鈴薯、煙草等經(jīng)濟作物和擬南芥等模式植物。,5、選擇受體細胞的基本原則,便于重組DNA分子的導入。便于重組體的篩選。根據(jù)所用的表達載體所含的選擇性標記與受體細胞基因是否相匹配，從

15、而易于對重組體進行篩選。遺傳穩(wěn)定性高，易于進行擴大培養(yǎng)或易于進行高密度發(fā)酵而不影響外源基因的表達效率。對動物細胞而言，所選用的受體細胞具有對培養(yǎng)的適應(yīng)性強，可以進行貼壁或懸浮培養(yǎng)，可以在無血清培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。,受體細胞內(nèi)內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)積累，可促進外源基因高效分泌表達。安全性高，無致病性，不會對外界環(huán)境造成生物污染。一般選用致病缺陷型的細胞或營養(yǎng)缺陷型細胞作為受體細胞。,能使重組D

16、NA分子穩(wěn)定存在于細胞中。從受體細胞的角度出發(fā)，通常的做法是對其作適當?shù)男揎椄脑欤邕x用某些限制性核酸內(nèi)切酶缺陷型的受體細胞就可以避免其對重組DNA分子的降解破壞作用。受體細胞在遺傳密碼子的應(yīng)用上無明顯偏倚性。具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機制等，便于真核目的基因的高效表達。在理論研究和生產(chǎn)實踐上有較高的應(yīng)用價值。,6、受體細胞應(yīng)具備的條件,野生型的大腸桿菌不是理想的受體細胞，因為自身具有的限制和修飾系統(tǒng)，另外還可能存在潛在的致病性因此

17、必須通過適當?shù)恼T變手段對野生型大腸桿菌進行遺傳性狀改造，以獲得適宜作為受體細胞的突變菌株通常應(yīng)從以下幾個方面加以考慮：從安全性考慮，應(yīng)具備以下條件：不適合在人體內(nèi)生存不適合在非培養(yǎng)條件下生存在非培養(yǎng)條件下，其DNA容易解體它的DNA不易轉(zhuǎn)移它的質(zhì)粒只在這一宿主由復制便于檢測,從遺傳性考慮：重組缺陷型recA－，用于基因擴增或高效表達的受體細胞（recA-）限制系統(tǒng)的缺陷，或是修飾系統(tǒng)的缺陷。避免對外源DNA的除解。

18、外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-） 與重組質(zhì)粒的遺傳性狀要有顯的差異（具有與載體選擇標記互補的表型）具有較高的轉(zhuǎn)化效率,限制缺陷型這是導致外源重組DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導效率低下的主要原因之一。應(yīng)選用限制系統(tǒng)缺陷型的突變菌株作為受體細胞，以提高外源DNA分子的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導效率。進一步使修飾系統(tǒng)也發(fā)生缺陷，則受體菌細胞既不能修飾，也不能限制外源DNA分子，更便于重組DNA分子的多種基因操作。大腸桿菌的限制系

19、統(tǒng)主要由 hsdR 基因編碼，因此具有 hsdR- 遺傳表型的大腸桿菌各株均喪失了降解外源DNA的能力，同時大大增加了外源 DNA的可轉(zhuǎn)化性。,重組缺陷型進入野生型細胞的外源DNA分子能自發(fā)地與染色體DNA發(fā)生的體內(nèi)同源重組反應(yīng)由rec基因家族的編碼產(chǎn)物所控制。RecA蛋白能促進DNA分子之間的同源聯(lián)會和DNA單鏈交換，recA基因的突變使大腸桿菌細胞內(nèi)的遺傳重組頻率降低至106。大腸桿菌的 recB、recC 和 recD

20、 基因分別編碼不同分子量的多肽鏈，三者構(gòu)成一個在同源重組中的統(tǒng)一功能單位—RecBCD蛋白（核酸酶V），它具有依賴于ATP的雙鏈DNA外切酶和單鏈 DNA內(nèi)切酶雙重活性。recB、recC和recD基因的突變也可以降低遺傳重組的發(fā)生頻率因此受體細胞必須選擇體內(nèi)同源重組缺陷型的遺傳表型基因型為recA-、recB-或recC-等，有些大腸桿菌突變體菌株則將三個基因同時失活。,轉(zhuǎn)化親和型可以利用遺傳誘變技術(shù)改變受體菌細胞壁的

21、通透性及細胞膜的特異吸附性，從而提高其轉(zhuǎn)化效率。還可以選擇能夠誘導形成感受態(tài)細胞的菌株作為受體菌細胞。,遺傳互補型遺傳表型差異大，可便于重組子的檢測。通常是使受體細胞呈現(xiàn)與載體所攜帶的選擇標記互補的遺傳性狀。方能使轉(zhuǎn)化細胞的篩選成為可能。如在大腸桿菌系統(tǒng)中，重組質(zhì)粒載體上多含有AMP抗性標記基因，則所選用的受體細胞應(yīng)對這種抗生素敏感。當重組DNA分子轉(zhuǎn)入受體細胞后載體上的標記基因賦予受體細胞抗生素的抗性特征，據(jù)此可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)

22、化子。如果受體細胞具有與外源基因表達產(chǎn)物活性互補的遺傳特征．可以直接篩選到外源基因表達的轉(zhuǎn)化細胞。,感染寄生缺陷型相當多的細菌對其它生物尤其是人和牲畜具有 感染和寄生效應(yīng)，重組 DNA 分子導入這些細 菌受體中后，極有可能隨著受體菌的感染寄生 作用，進入生物體內(nèi)，并廣泛圍傳播，如果外源基因?qū)θ梭w和牲畜有害，則會導致一 場災(zāi)難，因此從安全的角度上考慮，受體細胞 不能具有感染寄生性，當然，利用基因工程手 段制造

23、生物武器不在此例。,三、重組DNA導入受體細胞的方法,轉(zhuǎn)化(transformation):指感受態(tài)的大腸桿菌細胞捕獲質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA分子的過程。轉(zhuǎn)化子(transformant)：經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得外源遺傳物質(zhì)的細胞。轉(zhuǎn)染(transfection):指感受態(tài)的大腸桿菌細胞捕獲噬菌體或以它為載體構(gòu)建的重組DNA分子的過程轉(zhuǎn)導(transduction):指病毒轉(zhuǎn)移真核細胞DNA的過程或噬菌體介導的細菌細胞之間基

24、因轉(zhuǎn)移的過程。,基因?qū)胧荏w細胞方法根據(jù)轉(zhuǎn)移基因方法特性可分為：轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)導(transduction)轉(zhuǎn)染(transfection)微注射技術(shù)(microinjection)電轉(zhuǎn)化法(electroporation)基因槍技術(shù)(geneblaster)脂質(zhì)體介導法(liposome mediated transfer),根據(jù)轉(zhuǎn)移基因載體與受體的特性可分為：質(zhì)粒載體導入受體細胞的方法：Ca

25、Cl2、電轉(zhuǎn)化法等。噬菌體轉(zhuǎn)染細胞的方法：體外包裝感染法等。DNA導入酵母菌的方法：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔轉(zhuǎn)化法等。DNA導入植物細胞的方法：Ti質(zhì)粒葉盤法、電穿孔轉(zhuǎn)化法、基因槍法等。DNA導入昆蟲細胞的方法：桿狀病毒感染法等。DNA導入哺乳動物細胞的方法：磷酸鈣共沉淀法、電穿孔轉(zhuǎn)化法、脂質(zhì)體介導法、基因槍法等,1、氯化鈣轉(zhuǎn)化法大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，自然條件下很難進行轉(zhuǎn)化，其主要原因是轉(zhuǎn)化因子的吸收較為困難。在基因工程研

26、究和應(yīng)用中，轉(zhuǎn)化受體菌細胞的正是根據(jù)人們需要構(gòu)建的外源重組質(zhì)粒DNA分子而非來自供體菌的游離DNA片段(轉(zhuǎn)化因子)。因此在大腸桿菌的轉(zhuǎn)化實驗中，很少采取自然轉(zhuǎn)化的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制備感受態(tài)細胞，然后進行轉(zhuǎn)化處理，其中代表性的方法之一是Ca2+誘導的大腸桿菌轉(zhuǎn)化法。,1970年M.Mandel和A.Hige發(fā)現(xiàn),大腸桿菌經(jīng)過氯化鈣適當處理及短暫熱休克之后,便能吸收λ噬菌體DNA。1972年美國斯坦福大學 S.Cohe

27、n報道,經(jīng)氯化鈣處理大腸桿菌細胞也能攝取質(zhì)粒DNA。,Ca2+誘導轉(zhuǎn)化原理：①在0℃的Cacl2低滲溶液中，細菌細胞發(fā)生膨脹，同時Cacl2使細胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)促使細胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來，誘導大腸桿菌形成感受態(tài)。②Ca2+能與加入的DNA分子結(jié)合，形成抗DNA酶(DNase)的羥基-磷酸鈣復合物，并黏附在細菌細胞膜的外表面上。當42℃熱刺激短暫處理細菌細胞時，細胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動，并隨之出現(xiàn)許多間隙，

28、為DNA分子提供了進入細胞的通道。,Mg2+對DNA分子有很大的穩(wěn)定性作用，因此利用Mgcl2與Cacl2共同處理大腸桿菌細胞，可以提高DNA的轉(zhuǎn)化效率。如利用二甲基亞砜(DMSO)和二硫蘇糖醇(DDT)等進一步處理細胞，能誘導高頻感受態(tài)細胞的形成，轉(zhuǎn)化效率可提高100～1000倍，且對大小質(zhì)粒分子均可進行有效的轉(zhuǎn)化。但該法要求條件高，對外界污染物極為敏感，通常很少采用。,該法重復性好。操作簡便快捷，適用于成批制備感受態(tài)細胞。對這種感

29、受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化如果感受態(tài)細胞做得好，每微克超螺旋質(zhì)粒DNA可得5×107～1×109個轉(zhuǎn)化子。,大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備：100ml菌體培養(yǎng)至OD600 = 0.5，離心收集菌體。 用10 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液懸浮菌體，離心收集菌體。用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液懸浮菌體。 冰浴放置12 - 24小時，備用 。取100 ml感受態(tài)細胞，加入相當于50 ng載體的重組DNA連

30、接液，混勻。,冰浴放置半小時。 在42℃保溫1.5 分鐘（熱脈沖）。 快速將轉(zhuǎn)化細胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1 – 2 分鐘。 加入1 ml 新鮮培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng) 1 小時（擴增）。涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進行篩選。,獲得合格的感受態(tài)細胞，要注意以下幾點：用作受體菌的細胞在培養(yǎng)時要掌握好細胞密度，一般在A600為0.4左右為好。制備受體細胞的整個過程要在0～4℃進行，并盡量避免污染。如果用抗生素篩選轉(zhuǎn)化子，作為對照的受體菌

31、應(yīng)該在此培養(yǎng)基上不生長。為了提高轉(zhuǎn)化率，可選用復合氯化鈣溶液，如FSB溶液。,,CaCl2法制備感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化DNA時，低溫的主要目的是:（1）抑制細胞的旺盛生理代謝。（2）有助于DNA-Ca2+吸附于細胞表面。（3）防止DNAase降解DNA。熱休克溫度是42℃。目的是使細胞攝入吸附于其表面的DNA。,※,轉(zhuǎn)化處理過程中，可能感染雜菌，導致假陽性轉(zhuǎn)化子的出現(xiàn)，因此須設(shè)以下幾種對照處理：DNA對照處理。轉(zhuǎn)化處理液中用0.2

32、ml無菌水代替0.2m1感受態(tài)細胞，檢驗DNA溶液是否染菌。感受態(tài)細胞對照處理。轉(zhuǎn)化處理液中用0.1mlNTE緩沖液(500mM NaCl，10mM Tris-HCl，1mMEDTApH8.0)代替0.1m1DNA溶液，檢驗感受態(tài)細胞是否染菌。感受態(tài)細胞有效性對照處理。在0.2ml感受態(tài)細胞中加入0.1ml已知容易轉(zhuǎn)化這種感受態(tài)細胞的質(zhì)粒DNA。,2、PEG介導的細菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化革蘭氏陽性細菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接

33、納外源DNA的主要屏障是細胞壁，因而這類細菌通常采用原生質(zhì)體（細胞去壁后的形態(tài)）轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)粒或重組DNA分子 。酵母菌、霉菌、植物細胞也可用原生質(zhì)體法進行轉(zhuǎn)化。,PEG是乙二醇的多聚物, 存在不同分子量的多聚體,它可改變各類細胞的膜結(jié)構(gòu), 使兩細胞相互接觸部位的膜脂雙層中脂類分子發(fā)生疏散和重組,此時相互接觸的兩細胞的胞質(zhì)溝通成為可能,從而造成細胞之間發(fā)生融合。,細菌原生質(zhì)體的制備：不同細菌的原生質(zhì)體制備方法不盡相同，以鏈霉菌為

34、例：細菌需生長在高滲培養(yǎng)基中（如34%的蔗糖溶液），并加入甘氨酸以增加細菌細胞壁對溶菌酶的敏感性。在制備過程中，菌體應(yīng)始終懸浮在10.3%的蔗糖等滲溶液中。與原生質(zhì)體接觸的所有器皿應(yīng)保持無水無去污劑。,細菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：取0.2 - 1ml的原生質(zhì)體懸浮液（108-109個原生質(zhì)體），加入10 - 20 ml DNA重組連接液，同時加入含有PEG1000和Ca2+的等滲溶液，混勻。 細菌原生質(zhì)體的再生：原生質(zhì)體再生的主要目的是使

35、細菌重新長出細胞壁。再生在特殊的固體培養(yǎng)基上進行，內(nèi)含脯氨酸和微量元素。,3、電轉(zhuǎn)化,電轉(zhuǎn)化又稱電穿孔法(electroporation):是指在細胞上施加短暫、高壓的電流脈沖，在質(zhì)膜上形成納米大小的微孔，DNA直接通過這些微孔或者作為微孔閉合時所伴隨發(fā)生的膜組分重新分布通過質(zhì)膜進入細胞質(zhì)中，這種方法稱為電穿孔法。最早用于將DNA導入真核細胞,1988年,Dower等人成功應(yīng)用于大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。基本原理是利用高壓電脈沖作用，在大腸桿

36、菌細胞膜上進行電穿孔，形成可逆的瞬間通道,從而促進外源DNA的有效吸收。,將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒或DNA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場。在強大電場的作用下，細菌細胞壁和細胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進入細胞內(nèi)。電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻毎诮Y(jié)構(gòu)的受體細胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大。,電穿孔轉(zhuǎn)化法的效率受電場強度、電脈沖時間和外源DNA濃度等參數(shù)的影響，通過優(yōu)化這些參數(shù)，每μg DNA可以得到10

37、9～1010轉(zhuǎn)化子。電壓增高或電脈沖時間延長時，轉(zhuǎn)化效率將會有所提高，但同時導致受體細胞存活率的降低，轉(zhuǎn)化效率的提高也因此被抵消。,用于電穿孔轉(zhuǎn)化法的細胞處理要比感受態(tài)細胞的制備容易得多．當細菌生長到對數(shù)中期后予以冷卻、離心，然后用低鹽緩沖液充分清洗降低細胞懸浮液的離子強度，并用10％甘油重懸細胞，使其細胞濃度為3×l010個／m1。分裝，在干冰上速凍后置于 -70℃ 貯存。這樣，每小份細胞融解后即可用于轉(zhuǎn)化，有效期達6個月

38、以上。 電穿孔轉(zhuǎn)化須在低溫下(0-4℃)進行，轉(zhuǎn)化效率要比在室溫下操作提高約100倍。,4、接合轉(zhuǎn)化：接合（Conjugation）：指通過細菌細胞之間的直接接觸導致 DNA 從一個細胞轉(zhuǎn)移至另一個細胞的過程。這個過程是由結(jié)合型質(zhì)粒完成的，它通常具有促進供體細胞與受體細胞有效接觸的接合功能以及誘導 DNA分子傳遞的轉(zhuǎn)移功能，兩者均由接合型質(zhì)粒上的有關(guān)基因編碼,是基于非接合型質(zhì)粒的遷移作用而建立的一種DNA轉(zhuǎn)化方式．適用于那些難以采用

39、Ca2+誘導轉(zhuǎn)化法或電穿孔法轉(zhuǎn)化的受體菌。 非接合型質(zhì)粒分子較小，缺少編碼質(zhì)粒轉(zhuǎn)移體系所須的全部基因，不能象接合型質(zhì)粒那樣在宿主細胞間自我轉(zhuǎn)移。但如果宿主細胞中存在另外一種溶合性的接合型質(zhì)粒（即輔助質(zhì)粒）非接合型質(zhì)粒通常也會被轉(zhuǎn)移，這種由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程稱為遷移作用,接合型質(zhì)粒分子較大，自我轉(zhuǎn)移的隨意性強，轉(zhuǎn)移過程中經(jīng)常伴隨著宿主細胞染色體的高頻轉(zhuǎn)移，因此難以作為基因工程載體使用。目前常用的質(zhì)粒載體多是在非

40、接合型質(zhì)?；蛉笔Я私雍限D(zhuǎn)移基因的接合型質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，故重組質(zhì)粒DNA分子也不能直接接進行接合轉(zhuǎn)化。而只能通過其遷移作用來完成。,首先將具有接合轉(zhuǎn)化功能的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至含有重組質(zhì)粒的供體細胞中，然后將這種供體細胞與受體細胞進行混合，促使兩者發(fā)生接合轉(zhuǎn)化作用，將重組質(zhì)粒導入受體細胞。整個接合轉(zhuǎn)化過程涉及到3種有關(guān)的細菌菌株即待轉(zhuǎn)化的受體菌、含有要轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒DNA的供體菌和含有廣泛宿主的輔助質(zhì)粒的輔助菌，因此稱為三親本雜交接合轉(zhuǎn)化

41、法。,5、重組λ噬菌體DNA分子轉(zhuǎn)導大腸桿菌,轉(zhuǎn)染：將重組λ噬菌體DNA分子直接導入受體細胞中的過程，稱為轉(zhuǎn)染。 將重組λ噬菌體DNA分子導入大腸桿菌受體細胞的常規(guī)方法是轉(zhuǎn)導操作。轉(zhuǎn)導(transduction)：指通過λ噬菌體(病毒)顆粒感染宿主細胞的途徑把外源DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細胞內(nèi)的過程。,具有感染能力的λ噬菌體顆粒除含有λ噬菌體DNA分子外，還包括外被蛋白。以噬菌體顆粒感染受體細胞，首先必須對重組λ噬菌體DNA分子進行體

42、外包裝 。體外包裝，是指在體外模擬λ噬菌體DNA分子在受體細胞內(nèi)發(fā)生的一系列特殊的包裝反應(yīng)過程，將重組λ噬菌體DNA分子包裝為成熟的具有感染能力的λ噬菌體顆粒的技術(shù)。,基本原理：根據(jù)λ噬菌體DNA體內(nèi)包裝的途徑分別獲得缺失D包裝蛋白的λ噬菌體突變株和缺失E包裝蛋白的λ噬菌體突變株。這兩種突變株均不能單獨地包裝λ噬菌體DNA，但將它們分別感染大腸桿菌，從中提取缺失D蛋白的包裝物（含E蛋白)和缺失E蛋白的包裝物(含D蛋白)，兩者混合后就能

43、包裝λ噬菌體DNA。,λ噬菌體DNA體外包裝的主要過程,①制備包裝物。 須培養(yǎng)兩種溶原菌 誘導溶菌生長 收集和貯存包裝物。②體外包裝。制備λ噬菌體DNA混合液。第一次包裝。包裝物剛?cè)诨瘯r，細胞發(fā)生破裂，釋放出包裝物可立即用于包裝。 第二次包裝。進行第二次包裝，可提高包裝效率2－5倍，加入蛋白酶可降低包裝反應(yīng)液的黏度，便于包裝反應(yīng)的進行。去除細胞屑。第二次包裝后，在反應(yīng)液中加入SM溶液 （噬菌體稀釋緩沖液：100 mmo

44、l/L NaCl, 10 mmol/L MgSO4, 50 mmol/L Tris-HCL pH7.5)0.2%明膠和氯仿，混勻后離心去除碎屑。上清液中含活的噬菌體顆粒。,經(jīng)過體外包裝的噬菌體顆?？梢愿腥具m當?shù)氖荏w菌細胞，并將重組λ噬菌體DNA分子高效導入細胞中。在良好的體外包裝反應(yīng)條件下，每μg野生型的λ噬菌體DNA可形成108～109的pfu。對于重組的λ噬菌體DNA，包裝后的成斑率要比野生型的有所下降，但仍可達到106～107p

45、fu，完全可以滿足構(gòu)建真核基因組基因文庫的要求。,6、轉(zhuǎn)化率的計算及其影響因素 轉(zhuǎn)化率：指DNA分子轉(zhuǎn)化受體菌獲得轉(zhuǎn)化子的效率。轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標，有兩種表示方式：一是在待轉(zhuǎn)化 DNA分子數(shù)大于受體細胞數(shù)的條件下，轉(zhuǎn)化細胞與細胞總數(shù)之比。二是在受體細胞數(shù)相對于待轉(zhuǎn)化 DNA 分子數(shù)大大過量時，每微克 DNA 轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生的克隆數(shù)。也可表征為每微克 DNA 進入受體細胞的分子數(shù),影響轉(zhuǎn)化率的因素載體及重組DNA方面載體

46、本身的性質(zhì)：不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細胞，其轉(zhuǎn)化率不同。分子質(zhì)量較小的重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化率較高，分子質(zhì)量較大的重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化率較低，對于大于30kb的重組質(zhì)粒則很難進行轉(zhuǎn)化。 載體的空間構(gòu)象：與受體細胞親和性較強的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化率要高于親和性較弱的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復，一般要比新制備的超螺旋質(zhì)粒低兩個數(shù)量級。插入片段大?。簩|(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低

47、。重組DNA分子的濃度和純度：在10ng／100u1以下的DNA濃度范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與DNA分子數(shù)成正比關(guān)系。,※,受體細胞方面：受體細胞必須與載體相匹配，如：pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM83株，轉(zhuǎn)化率很低；但對大腸桿菌ED8767株的轉(zhuǎn)化率則較高。轉(zhuǎn)化操作方面：受體細胞的預(yù)處理或感受態(tài)細胞的制備對轉(zhuǎn)化率影響最大對于Ca2+誘導的完整細胞轉(zhuǎn)化而言，菌齡、CaCl2處理時間感受態(tài)細胞的保存期以及熱脈沖時間均是很重要的因素，其中感受

48、態(tài)細胞通常在 12-24小時內(nèi)轉(zhuǎn)化率最高，之后轉(zhuǎn)化率急劇下降。對于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化而言，再生率的高低直接影響轉(zhuǎn)化率，而原生質(zhì)體的再生率又受諸多因素的制約在一次轉(zhuǎn)化實驗中，DNA分子數(shù)與受體細胞數(shù)的比例對轉(zhuǎn)化率也有影響。電穿孔轉(zhuǎn)化法中，對受體細胞進行冰凍甘油預(yù)處理后的轉(zhuǎn)化率，要比不經(jīng)此預(yù)處理的轉(zhuǎn)化率高10-100倍。,同一重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化不同的受體菌細胞，轉(zhuǎn)化率不同——受體細胞的選擇對于重組DNA分子的轉(zhuǎn)化也是極為重要。受體細胞的預(yù)

49、處理：影響最大供受體的比例： Ca2+誘導轉(zhuǎn)化 0.1 ml 感受態(tài)細胞 50 ng DNA 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 109 個原生質(zhì)體 50 ng DNA,提高轉(zhuǎn)化效率的幾個重要因素： ①細胞生長狀態(tài)和密度 不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于４℃的培養(yǎng)菌，最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600來控制。DH5α菌株的OD600 為0

50、.5時，細胞密度在5×107 個/ml左右(不同的菌株情況有所不同)，這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。,②質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度:用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋DNA(cccDNA)轉(zhuǎn)化效率與外源DNA濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當加入的外源DNA量過多或體積過大時，轉(zhuǎn)化效率就會降低。1ng的cccDNA即可使50μl的感受態(tài)細胞達到飽和。一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細胞體積的5％。,③試劑的質(zhì)量

51、所用的試劑，如CaCl2 等均需是最高純度的，并用超純水配制（過濾除菌，非高壓滅菌），最好分裝保存于干燥的冷暗處（冰箱4℃）。 ④防止雜菌和雜DNA的污染整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管, 槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入，為以后的篩選和鑒定帶來不必要的麻煩。,擴增操作 轉(zhuǎn)化細胞的擴增操作：指轉(zhuǎn)化完

52、成之后細胞的短時間培養(yǎng)。在實驗時，擴增操作往往與轉(zhuǎn)化操作偶聯(lián)在一起，如：Ca2+誘導轉(zhuǎn)化后的37℃培養(yǎng)一個小時原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的再生過程λ噬菌體轉(zhuǎn)染后的30℃培養(yǎng)等，均屬擴增操作擴增操作的目的增殖轉(zhuǎn)化細胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細胞用于篩選程序。擴增和表達載體分子上的標記基因，便于篩選。表達外源基因，便于篩選和鑒定。,四、轉(zhuǎn)化細胞的擴增,五、外源基因?qū)胝婧思毎姆椒?1．重組DNA分子導入酵母細胞：利用酵母的原生質(zhì)球進行轉(zhuǎn)

53、化 首先，酶解酵母細胞壁，產(chǎn)生原生質(zhì)球，再將原生質(zhì)球置于DNA、CaCl2和多聚醇(如聚乙二醇)中多聚醇可使細胞壁具有穿透性，并允許DNA進入然后使原生質(zhì)球懸浮于瓊脂中，并使其再生新的細胞壁。,2 、重組DNA分子導入哺乳動物細胞,①病毒顆粒轉(zhuǎn)導法病毒種類多樣及病毒DNA或RNA構(gòu)建的載體性質(zhì)的各異，所以轉(zhuǎn)導的過程各不相同，主要有三種類型：一，帶有目的基因的病毒顆粒直接感染受體細胞，目的基因隨同病毒DNA分子整合到受體細胞

54、染色體DNA上這樣以后不需要再包裝成病毒顆粒。二，帶有目的基因的毒病是缺陷性的，須同另一輔助病毒一起感染受體細胞．在受體細胞內(nèi)包裝成新的病毒顆粒。三，雖然帶目的基因的SV40病毒是早期轉(zhuǎn)錄缺陷型的但被感染的COS細胞系的基因組中整合有SV40早期轉(zhuǎn)錄區(qū)段DNA，所以沒有必要用輔助病毒作混合感染。,②磷酸鈣-DNA共沉淀法是指外源基因與磷酸鈣混合形成磷酸鈣-DNA共沉淀物，可使DNA附在細胞表面，通過細胞吞入攝取或通過細胞膜脂相收縮

55、時裂開的空隙進入細胞內(nèi)，這種轉(zhuǎn)染方法稱為磷酸鈣-DNA共沉淀法。其依據(jù)是哺乳動物細胞能捕獲黏附在細胞表面的DNA-磷酸鈣沉淀物，使DNA轉(zhuǎn)入細胞。,進入細胞的DNA僅有1%～5%可以進入細胞核中，其中僅有不到1%的DNA可以與細胞DNA整合，在細胞中進行穩(wěn)定表達，基因轉(zhuǎn)導頻率大約為10-4，這項技術(shù)能用于任何DNA導入哺乳類動物進行暫時性表達或長期轉(zhuǎn)化的研究。DNA磷酸鈣共沉淀復合物中DNA的數(shù)量、共沉淀物與細胞接觸的保溫時間、以及

56、DMSO和甘油等促進因子作用的持續(xù)時間均會影響DNA的轉(zhuǎn)染效率。此方法對于貼壁細胞轉(zhuǎn)染是最常用并首選的方法,③DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法二乙胺乙基葡聚糖(DEAE)是一種高分子質(zhì)量的多聚陽離子試劑，能促進哺乳動物細胞捕獲外源DNA，實現(xiàn)短時間的有效表達。 目前有關(guān)DEAE-葡聚糖的作用機制一般認為DEAE-葡聚糖能與外源DNA形成復合物，保護DNA免受核酸酶的降解；其次是DEAE-葡聚糖可作用于受體細胞膜，增加其通透性，便于DNA進入

57、。 此方法簡單、重復性高，并且轉(zhuǎn)染效率高于磷酸鈣法。,DEAE-dextran轉(zhuǎn)染主要有兩種不同的方法： 一種是先使DNA直接同DEAE-dextran混合，形成DNA／DEAE-dextran復合物后，再用來處理細胞。 另一種是受體細胞先用DEAE—dextran溶液預(yù)處理，然后再用來與轉(zhuǎn)染的DNA接觸。,④聚陽離子-DMSO轉(zhuǎn)染法采用聚陽離子poly-brene處理哺乳動物細胞，增加細胞表面對DNA的吸附能力、然后再用25

58、％-30％DMSO短暫處理細胞，增加膜的通透性，提高對DNA的捕獲量。,,⑤顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)微注射技術(shù)：一般是用微吸管吸取供體DNA溶液，在高倍倒置顯微鏡下準確地插入受體細胞核中，并將DNA注射進去。常用于轉(zhuǎn)基因動物研究用此方法轉(zhuǎn)基因的效率很高。獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子的數(shù)量取決于注射的DNA的性質(zhì)。,顯微注射法其技術(shù)關(guān)鍵：理想外源基因的制備。這種基因可處于質(zhì)粒上，但注射前質(zhì)粒已經(jīng)酶切而線性化。有的載體DNA會干擾外源基因的表達，因此注射

59、前，需要先從載體上將它們切下。收集受精卵。在受孕后的幾小時內(nèi)，父母雙方的遺傳物質(zhì)還未結(jié)合前，從供體動物中取出單細胞的受精卵。,顯微注射。利用極細的毛細玻璃管(外徑為0.5-1um)，將理想的遺傳物質(zhì)注入受精卵的雄原核。這必須在父母雙方遺傳物質(zhì)融合前的4h間歇期內(nèi)完成。當雙親染色體相遇后，注入的理想基因有可能整合到染色體上。 在幾次細胞分裂后，將帶有理想基因的受精卵移入母體，使受精卵孕育。,⑥脂質(zhì)體導入法脂質(zhì)體也稱人工細胞膜，是由脂

60、質(zhì)雙分子層組成的，磷脂分子在水中可自動生成閉合的雙層膜,從而形成一種囊狀物被稱為脂質(zhì)體。脂質(zhì)體導入法:將DNA或RNA包囊于脂質(zhì)體內(nèi)，然后進行脂質(zhì)體與細胞膜的融合，通過融合導入細胞,這種轉(zhuǎn)染方法稱為脂質(zhì)體導入法。,脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染的機制陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用將DNA分子包裹人內(nèi)，形成DNA一脂復合體，也能被表面帶負電荷的細胞膜吸附，再通過膜的融合或細胞的內(nèi)吞作用，偶爾也通過直接滲透作用,將DNA傳遞進入

61、細胞，形成包涵體或進入溶酶體,其中一小部分DNA能從包涵體內(nèi)釋放,并進入細胞質(zhì)中,再進一步進入核內(nèi)轉(zhuǎn)錄、表達。,利用脂質(zhì)體介導法將外源DNA導入哺乳動物細胞具有實用潛力。由于脂質(zhì)體具有無毒、無免疫原性的特點，不僅可用于體外受體細胞的基因轉(zhuǎn)化，而且可以在動物體內(nèi)將基因轉(zhuǎn)入肝細胞、血管內(nèi)皮細胞等靶細胞或靶組織、靶器官位點，實現(xiàn)瞬間表達或穩(wěn)定表達，成為基因治療的一種有效工具。,⑦基因槍法基因槍法(又稱粒子轟擊法)用高壓氣體加速把粘有DN