低氧調(diào)節(jié)大鼠CRFR1受體細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路.pdf

1、背景和目的：
　　 低氧(Hypoxia)是生物體在自然活動(dòng)中可能受到的主要應(yīng)激之一，它對(duì)包括人類在內(nèi)的生物的發(fā)育、行為和健康狀況等有著重要影響。它是一種非特異性應(yīng)激原，它可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(Hypothalamus-pituitary-adrenalaxis，HPA)是機(jī)體重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)和應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)，對(duì)各種應(yīng)激做出應(yīng)答反應(yīng)，以新的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，適應(yīng)變化了的不利環(huán)境。下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激

2、素(Corticotropinreleasingfactor，CRF)肽是HPA軸的腦中樞調(diào)節(jié)者，它調(diào)節(jié)神經(jīng)和體液兩大系統(tǒng)。CRF通過(guò)與CRFR1(Corticotropin-releasingfactorreceptor1)和CRFR2(Corticotropin-releasingfactorreceptor2)兩個(gè)主要的受體結(jié)合發(fā)揮作用。CRFR1屬G-蛋白偶聯(lián)受體(G-proteincoupledreceptor，GPCRs)家

3、族，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織廣泛分布。CRFR1參與低氧應(yīng)激生理功能調(diào)節(jié)，對(duì)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中重要低氧靶基因和蛋白起核心主導(dǎo)調(diào)節(jié)作用。
　　 β-Arrestin是G蛋白偶聯(lián)受體(G-proteincoupledreceptor，GPCRs)信號(hào)通路的重要負(fù)調(diào)節(jié)因子，與G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G-protein-coupledreceptorkinases，GRK)聯(lián)合作用，可以使GPCRs對(duì)激動(dòng)劑的敏感性下降，發(fā)生受體的

4、脫敏反應(yīng)，調(diào)節(jié)受體內(nèi)吞、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞凋亡等。首先，被激動(dòng)劑激活的GPCRs與GRK結(jié)合發(fā)生磷酸化，促使β-Arrestin從非活化的晶體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)受體高親和結(jié)構(gòu)，與磷酸化的活化GPCRs結(jié)合，形成三聚體，阻止了受體與G蛋白之間的繼續(xù)作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)室利用低氣壓艙模擬高原低氧，從整體和細(xì)胞水平，系統(tǒng)地研究了高原低氧應(yīng)激與適應(yīng)及其作用機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖茄芯考毙院瓦B續(xù)慢性低氧對(duì)大鼠大腦前額葉皮層CRF、CRFR1、CRFR2、

5、GRK3和β-Arrestin1/2基因表達(dá)的影響，分析低氧調(diào)節(jié)CRFR1受體的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路；利用培養(yǎng)大鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，研究神經(jīng)肽CRF對(duì)細(xì)胞內(nèi)β-Arrestin1/2、Gαs、cAMP、PKC等分子表達(dá)的調(diào)節(jié)。
　　 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法：
　　 利用低氧艙模擬高原低氧的方法，將實(shí)驗(yàn)大鼠暴露于低氧7km(8.0％O2，41.83kPa)8h和24h，5km(10.8％O2，54.02kPa)連續(xù)低氧5d和15d，動(dòng)物

6、在低氧暴露結(jié)束后被犧牲，大腦用于本實(shí)驗(yàn)研究。采用實(shí)時(shí)定量PCR研究低氧對(duì)大鼠大腦前額葉皮層CRF、CRHR1、CRHR2、GRK3和β-Arrestin1/2基因表達(dá)的影響。培養(yǎng)大鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，研究神經(jīng)肽CRF對(duì)β-Arrestin1/2、Gαs、cAMP、PKC亞型表達(dá)的調(diào)節(jié)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1.急性7km低氧8h可以增加大鼠大腦前額葉皮層CRFmRNA表達(dá)，而7km低氧24hCRFmRNA表達(dá)和對(duì)照組

7、相比沒(méi)有顯著性差異；急性7km低氧8h可以增加大鼠大腦前額葉皮層CRFR1mRNA表達(dá)，而7km低氧24h，CRFR1mRNA表達(dá)明顯減少；7km低氧8h后大鼠大腦前額葉皮層CRFR2mRNA表達(dá)明顯減少，而7km低氧24hCRFR2mRNA表達(dá)沒(méi)有顯著性差異；而5km連續(xù)慢性低氧5d和15d后，CRF、CRFR1和CRFR2mRNA基因表達(dá)回復(fù)到對(duì)照水平，與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異。
　　 2.急性7km低氧8h可以增加大鼠大腦前

8、額葉皮層GRK3mRNA表達(dá)，而7km低氧24h，GRK3mRNA表達(dá)明顯減少，5km低氧連續(xù)5d明顯降低GRK3mRNA表達(dá)，而連續(xù)15d低氧后，GRK3mRNA表達(dá)恢復(fù)對(duì)照水平。
　　 3.7km低氧8h后大鼠大腦前額葉皮層β-Arrestin1mRNA表達(dá)明顯減少，7km低氧24h后β-Arrestin1mRNA表達(dá)沒(méi)有差異；5km連續(xù)低氧5d后，β-Arrestin1mRNA表達(dá)沒(méi)有差異，而在5km連續(xù)15d低氧后β-A

9、rrestin1mRNA表達(dá)明顯升高。7km低氧8h大鼠大腦前額葉皮層β-Arrestin2mRNA表達(dá)沒(méi)有差異，而在7km低氧24h后β-Arrestin2mRNA表達(dá)明顯減少；慢性5km連續(xù)低氧5d和15d對(duì)β-Arrestin2mRNA表達(dá)沒(méi)有影響。
　　 4.在原代星型膠質(zhì)細(xì)胞，CRF孵育30min可以顯著升高細(xì)胞Gαs、cAMP表達(dá)；CRF孵育8h后PKCε亞型蛋白表達(dá)有顯著上升，但PKCβⅡ蛋白表達(dá)無(wú)變化；同時(shí)發(fā)現(xiàn)C

10、RF孵育8h顯著降低了β-Arrestin1mRNA表達(dá)，而β-Arrestin2mRNA表達(dá)沒(méi)有變化。
　　 小結(jié)：
　　 急性低氧7km8h上調(diào)GRK3、CRF和CRFR1，下調(diào)CRFR2受體基因表達(dá)，而7km24h嚴(yán)重低氧抑制GRK3、CRF、CRFR1和CRFR2受體基因表達(dá)，同時(shí)也抑制β-Arrestin2mRNA；慢性連續(xù)低氧通過(guò)增加β-Arrestin1mRNA下調(diào)CRFR1受體基因表達(dá)，是CRFR1受體脫

11、敏的機(jī)制之一。機(jī)體CRF分泌的減少，以及β-Arrestin1mRNA的增加使CRFR1受體脫敏可能是機(jī)體對(duì)慢性低氧的反應(yīng)性降低的基礎(chǔ)。
　　 在原代星型膠質(zhì)細(xì)胞，CRF短時(shí)通過(guò)細(xì)胞CRFR1受體活化的Gαs.cAMP的調(diào)節(jié)PKA信號(hào)通路。而長(zhǎng)時(shí)調(diào)節(jié)PKC信號(hào)通路主要是通過(guò)PKCε亞型，不是PKCβⅡ。CRF孵育8h后β-Arrestin1mRNA表達(dá)下調(diào)與整體大鼠急性低氧7km的結(jié)果一致，提示嚴(yán)重低氧或高水平CRF暴露抑制β-