RA與WNT信號(hào)通路聯(lián)合調(diào)節(jié)神經(jīng)元前體細(xì)胞分化的體外研究.pdf

1、神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)是一種具有自我更新，自我增殖和分化成多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞潛力的未分化的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)神經(jīng)元前體細(xì)胞(neural progenitor cells,NPCs)和膠質(zhì)前體細(xì)胞階段，最終分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。體外培養(yǎng)NPCs時(shí)，表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth

2、 factor,bFGF)具有促進(jìn)增殖的作用，并最終使NPCs增殖形成具有分化潛能的神經(jīng)球；若撤去促進(jìn)增殖的因素時(shí)，神經(jīng)球?qū)?huì)分化成神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞；因此對(duì)于 NPCs研究的重點(diǎn)就在如何控制 NPCs向預(yù)定的細(xì)胞方向分化，并達(dá)到對(duì)疾病治療的目的。在神經(jīng)球的培養(yǎng)中，許多細(xì)胞內(nèi)源性的和外源性的因素均可調(diào)節(jié) NPCs的增殖、遷移和分化；NPC培養(yǎng)技術(shù)為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究提供了一個(gè)較為理想和可行的細(xì)胞培養(yǎng)模型；通過(guò)對(duì)胚胎、胎兒

3、或者成年機(jī)體獲得的 NSCs予以適當(dāng)誘導(dǎo)，然后進(jìn)行移植治療，對(duì)于損傷或疾病所導(dǎo)致的大腦和脊髓的神經(jīng)元變性或許會(huì)得到逆轉(zhuǎn)。
　　維甲酸(retinoic acid,RA)是一個(gè)由維生素A轉(zhuǎn)化而來(lái)的親脂性的小分子化合物，在胚胎形成，發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞，在給予 RA刺激時(shí)會(huì)促進(jìn)干細(xì)胞增殖；對(duì)于發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，RA促進(jìn)干細(xì)胞向著膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞方向的分化以及少突膠質(zhì)-GABA能神經(jīng)元方向的

4、分化。Wnt信號(hào)通路是器官發(fā)育過(guò)程中高度保守的信號(hào)通路。不論是在胚胎的神經(jīng)發(fā)生，還是在成年神經(jīng)系統(tǒng)的干細(xì)胞，Wnt信號(hào)均具有調(diào)節(jié)NPCs分化和增殖的作用；對(duì)于神經(jīng)變性性和神經(jīng)退行性疾病，Wnt信號(hào)同樣扮演著十分重要的角色；通過(guò)對(duì)體外培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行Wnt配體刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Wnt除了能促進(jìn)干細(xì)胞增殖和自我更新，促進(jìn)神經(jīng)球的形成和增長(zhǎng)之外，還具有促進(jìn)其向GABA能神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞方向的分化的潛能。在發(fā)育中，RA和Wnt信號(hào)通常作為腹、背

5、兩極的形態(tài)發(fā)生信號(hào)，協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)著組織的生長(zhǎng)和肝細(xì)胞的分化，因此，在神經(jīng)干細(xì)胞中，二者有可能協(xié)調(diào)發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化。
　　但有關(guān)RA和Wnt信號(hào)相互影響及其相互之間在神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化中相互作用機(jī)制的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道?；诖?，本實(shí)驗(yàn)擬在體外培養(yǎng)胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的基礎(chǔ)上，研究?jī)烧吖餐深A(yù)NSCs時(shí)，會(huì)對(duì)NSCs的自我更新和增殖產(chǎn)生什么樣的影響？
　　第一部分、RA和Wnt信號(hào)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響
　

6、　1.方法：
　　培養(yǎng)離體胚胎神經(jīng)干細(xì)胞；在神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化下，進(jìn)行RA處理、Wnt3a處理以及兩者聯(lián)合；采用 BrdU示蹤方法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力的變化；采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色和Western Blot技術(shù)觀察少突膠質(zhì)-GABA能神經(jīng)元共同前體細(xì)胞標(biāo)記蛋白DLX2，少突膠質(zhì)前體細(xì)胞標(biāo)記蛋白NG2，GABA能神經(jīng)元標(biāo)記蛋白GAD67，神經(jīng)元特異性標(biāo)記蛋白TUJ1，以及星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白GFAP表達(dá)的變化。
　　2.結(jié)果

7、：
　　RA和Wnt3a單獨(dú)處理時(shí)，均可顯著增加BrdU陽(yáng)性的神經(jīng)干細(xì)胞、GABA能神經(jīng)元的GAD67陽(yáng)性的細(xì)胞的數(shù)目以及TUJ1陽(yáng)性的神經(jīng)元細(xì)胞（P<0.05）；Wnt3a可增加少突膠質(zhì)-GABA能神經(jīng)元的共同前體細(xì)胞即Dlx2陽(yáng)性和少突膠質(zhì)前體細(xì)胞即NG2陽(yáng)性的細(xì)胞和細(xì)胞數(shù)量（P<0.05），然而RA抑制Dlx2和NG2的表達(dá)（P<0.05）。RA和Wnt3a聯(lián)合使用時(shí)，抑制神經(jīng)干細(xì)胞增殖，降低Dlx2,NG2，GAD67以及

8、TUJ1神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。在神經(jīng)干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞方向的分化時(shí)，RA和Wnt3a均不同程度地抑制神經(jīng)干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞方向的分化（P<0.05），而兩者聯(lián)合使用時(shí)GFAP陽(yáng)性的星型膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目則有回到了對(duì)照組的水平。
　　3.結(jié)論：
　　RA和Wnt3a均可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和向少突膠-GABA能神經(jīng)元方向的分化的作用，同時(shí)抑制其向星形膠質(zhì)細(xì)胞方向的分化；RA和Wnt3a聯(lián)合使用時(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化能力又恢復(fù)到了

9、對(duì)照組的水平，提示RA和Wnt信號(hào)之間可能存在相互拮抗的特性。
　　第二部分、RA和Wnt信號(hào)之間的相互作用及β-catenin對(duì)RA/Wnt相互拮抗作用的挽救
　　1.方法：
　　培養(yǎng)離體胚胎神經(jīng)干細(xì)胞，采用過(guò)表達(dá)β-catenin的慢病毒感染神經(jīng)干細(xì)胞，然后進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，如實(shí)驗(yàn)第一部分方法所述采用BrdU增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞自我增殖能力的變化，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)DLX2，NG2,GAD67以及G

10、FAP的變化,采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)RA信號(hào)通路和Wnt信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　2.結(jié)果：
　　RA可上調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路神經(jīng)干細(xì)胞中的關(guān)鍵分子β-catenin，以及Wnt信號(hào)的靶基因Axin2和Cyclin D1的表達(dá)；Wnt3a在RA信號(hào)通路中則可上調(diào)RA降解過(guò)程中的關(guān)鍵酶cyp26B1和下調(diào)RA信號(hào)的胞內(nèi)關(guān)鍵分子Raldh3的表達(dá)。RA和Wnt3a共同刺激抑制β-catenin

11、的表達(dá)。與RA/Wnt3a聯(lián)合刺激相比，β-catenin過(guò)表達(dá)刺激可明顯增加少突膠質(zhì)細(xì)胞-GABA能神經(jīng)元的共同前體細(xì)胞即Dlx2陽(yáng)性的細(xì)胞，少突膠質(zhì)前體細(xì)胞即NG2陽(yáng)性的細(xì)胞和GABA能神經(jīng)元的GAD67陽(yáng)性的細(xì)胞的數(shù)目以及TUJ1陽(yáng)性的神經(jīng)元細(xì)胞（P<0.05）和BrdU標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞（P<0.05）；而對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞方向的分化出現(xiàn)一定程度的下降，提示β-catenin過(guò)表達(dá)可挽救RA與Wnt信號(hào)在神經(jīng)干細(xì)胞中的相