RA與WNT信號通路聯(lián)合調節(jié)神經元前體細胞分化的體外研究.pdf

1、神經干細胞(neural stem cells,NSCs)是一種具有自我更新，自我增殖和分化成多種中樞神經系統(tǒng)細胞潛力的未分化的細胞，經過神經元前體細胞(neural progenitor cells,NPCs)和膠質前體細胞階段，最終分化為神經元、星型膠質細胞和少突膠質細胞。體外培養(yǎng)NPCs時，表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth

2、 factor,bFGF)具有促進增殖的作用，并最終使NPCs增殖形成具有分化潛能的神經球；若撤去促進增殖的因素時，神經球將會分化成神經元、星型膠質細胞或少突膠質細胞；因此對于 NPCs研究的重點就在如何控制 NPCs向預定的細胞方向分化，并達到對疾病治療的目的。在神經球的培養(yǎng)中，許多細胞內源性的和外源性的因素均可調節(jié) NPCs的增殖、遷移和分化；NPC培養(yǎng)技術為神經系統(tǒng)疾病的研究提供了一個較為理想和可行的細胞培養(yǎng)模型；通過對胚胎、胎兒

3、或者成年機體獲得的 NSCs予以適當誘導，然后進行移植治療，對于損傷或疾病所導致的大腦和脊髓的神經元變性或許會得到逆轉。
　　維甲酸(retinoic acid,RA)是一個由維生素A轉化而來的親脂性的小分子化合物，在胚胎形成，發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的小鼠胚胎干細胞，在給予 RA刺激時會促進干細胞增殖；對于發(fā)育中的中樞神經系統(tǒng)，RA促進干細胞向著膠質細胞前體細胞方向的分化以及少突膠質-GABA能神經元方向的

4、分化。Wnt信號通路是器官發(fā)育過程中高度保守的信號通路。不論是在胚胎的神經發(fā)生，還是在成年神經系統(tǒng)的干細胞，Wnt信號均具有調節(jié)NPCs分化和增殖的作用；對于神經變性性和神經退行性疾病，Wnt信號同樣扮演著十分重要的角色；通過對體外培養(yǎng)的胚胎干細胞進行Wnt配體刺激，結果發(fā)現(xiàn)Wnt除了能促進干細胞增殖和自我更新，促進神經球的形成和增長之外，還具有促進其向GABA能神經元及膠質細胞方向的分化的潛能。在發(fā)育中，RA和Wnt信號通常作為腹、背

5、兩極的形態(tài)發(fā)生信號，協(xié)調調節(jié)著組織的生長和肝細胞的分化，因此，在神經干細胞中，二者有可能協(xié)調發(fā)揮作用，調節(jié)神經干細胞的增殖分化。
　　但有關RA和Wnt信號相互影響及其相互之間在神經干細胞的增殖與分化中相互作用機制的研究目前尚未見報道?；诖?，本實驗擬在體外培養(yǎng)胚胎神經干細胞的基礎上，研究兩者共同干預NSCs時，會對NSCs的自我更新和增殖產生什么樣的影響？
　　第一部分、RA和Wnt信號對神經干細胞增殖分化的影響
　

6、　1.方法：
　　培養(yǎng)離體胚胎神經干細胞；在神經干細胞的誘導分化下，進行RA處理、Wnt3a處理以及兩者聯(lián)合；采用 BrdU示蹤方法檢測神經干細胞增殖能力的變化；采用免疫細胞化學染色和Western Blot技術觀察少突膠質-GABA能神經元共同前體細胞標記蛋白DLX2，少突膠質前體細胞標記蛋白NG2，GABA能神經元標記蛋白GAD67，神經元特異性標記蛋白TUJ1，以及星型膠質細胞標記蛋白GFAP表達的變化。
　　2.結果

7、：
　　RA和Wnt3a單獨處理時，均可顯著增加BrdU陽性的神經干細胞、GABA能神經元的GAD67陽性的細胞的數(shù)目以及TUJ1陽性的神經元細胞（P<0.05）；Wnt3a可增加少突膠質-GABA能神經元的共同前體細胞即Dlx2陽性和少突膠質前體細胞即NG2陽性的細胞和細胞數(shù)量（P<0.05），然而RA抑制Dlx2和NG2的表達（P<0.05）。RA和Wnt3a聯(lián)合使用時，抑制神經干細胞增殖，降低Dlx2,NG2，GAD67以及

8、TUJ1神經細胞標記物的表達。在神經干細胞向星形膠質細胞方向的分化時，RA和Wnt3a均不同程度地抑制神經干細胞向星形膠質細胞方向的分化（P<0.05），而兩者聯(lián)合使用時GFAP陽性的星型膠質細胞數(shù)目則有回到了對照組的水平。
　　3.結論：
　　RA和Wnt3a均可促進神經干細胞增殖和向少突膠-GABA能神經元方向的分化的作用，同時抑制其向星形膠質細胞方向的分化；RA和Wnt3a聯(lián)合使用時，神經干細胞增殖、分化能力又恢復到了

9、對照組的水平，提示RA和Wnt信號之間可能存在相互拮抗的特性。
　　第二部分、RA和Wnt信號之間的相互作用及β-catenin對RA/Wnt相互拮抗作用的挽救
　　1.方法：
　　培養(yǎng)離體胚胎神經干細胞，采用過表達β-catenin的慢病毒感染神經干細胞，然后進行神經干細胞的誘導分化，如實驗第一部分方法所述采用BrdU增殖實驗檢測神經干細胞自我增殖能力的變化，采用免疫細胞化學染色檢測DLX2，NG2,GAD67以及G

10、FAP的變化,采用Western Blot技術檢測RA信號通路和Wnt信號通路中相關蛋白的表達。
　　2.結果：
　　RA可上調Wnt/β-catenin信號通路神經干細胞中的關鍵分子β-catenin，以及Wnt信號的靶基因Axin2和Cyclin D1的表達；Wnt3a在RA信號通路中則可上調RA降解過程中的關鍵酶cyp26B1和下調RA信號的胞內關鍵分子Raldh3的表達。RA和Wnt3a共同刺激抑制β-catenin

11、的表達。與RA/Wnt3a聯(lián)合刺激相比，β-catenin過表達刺激可明顯增加少突膠質細胞-GABA能神經元的共同前體細胞即Dlx2陽性的細胞，少突膠質前體細胞即NG2陽性的細胞和GABA能神經元的GAD67陽性的細胞的數(shù)目以及TUJ1陽性的神經元細胞（P<0.05）和BrdU標記的神經干細胞（P<0.05）；而對于神經干細胞向星形膠質細胞方向的分化出現(xiàn)一定程度的下降，提示β-catenin過表達可挽救RA與Wnt信號在神經干細胞中的相