甘氨酸受體細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制研究.pdf

1、目的： 明確甘氨酸受體(Glycine receptor，GlyR)介導(dǎo)甘氨酸細(xì)胞保護(hù)作用的下游信號(hào)通路，闡明甘氨酸拮抗細(xì)胞ATP耗竭性損傷的分子機(jī)制，為發(fā)現(xiàn)新型細(xì)胞保護(hù)劑提供理論依據(jù)。 方法： 本研究首先使用呼吸鏈抑制劑聯(lián)合無糖培養(yǎng)基共同作用復(fù)制細(xì)胞ATP耗竭模型。將犬腎細(xì)胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)分為ATP耗竭組和Gly(Glycine)保護(hù)組，運(yùn)用Western bl

2、ot檢測ERK1/2、p38MAPK、JNK1/2和AKT的磷酸化活性變化。分別運(yùn)用ERK1/2和AKT的阻斷劑PD98059、LY294002，觀察各組LDH釋放率的變化。將構(gòu)建好的pcDNA3.1-GlyRα1真核表達(dá)載體，應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)將該質(zhì)粒導(dǎo)入野生型人胚腎細(xì)胞(Humanembryonic kidney 293，HEK293)，再用G418篩選穩(wěn)定的細(xì)胞表達(dá)系。將穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系和野生型HEK293細(xì)胞處于ATP耗竭和

3、Gly保護(hù)狀態(tài)下，運(yùn)用Western blot檢測ERK1/2、p38MAPK、JNK1/2和AKT的磷酸化活性變化。選用使MDCK細(xì)胞中GlyRα1表達(dá)下調(diào)最明顯的siRNA2，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染入MDCK細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染后48小時(shí)使其處于ATP耗竭狀態(tài)，運(yùn)用Western blot觀察siRNA2對GlyRα1表達(dá)的抑制效果，并運(yùn)用Western blot檢測ERK1/2、p38MAPK、JNK1/2和AKT的磷酸化活性變化。 結(jié)果：

4、 MDCK細(xì)胞處于ATP耗竭狀態(tài)下15min、30min、1h、2h后，Gly保護(hù)組與ATP耗竭組相比，ERK1/2、AKT的磷酸化活性均增強(qiáng)，p38MAPK的磷酸化活性減弱，而JNK1/2的磷酸化活性沒有變化。分別加入阻斷劑PD98059和LY294002以后，Gly保護(hù)組的LDH釋放率與對照組相比均有升高。 將穩(wěn)定表達(dá)GlyRα1的HEK293細(xì)胞和野生型HEK293細(xì)胞處于ATP耗竭狀態(tài)1h。穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系中，Gl

5、y保護(hù)組與ATP耗竭組相比， ERK1/2、AKT的磷酸化活性均增強(qiáng)，p38MAPK的磷酸化活性減弱，JNK1/2的磷酸化活性沒有改變。野生型HEK293細(xì)胞中，Gly保護(hù)組和ATP耗竭組相比，ERK1/2、p38MAPK、JNK1/2和AKT的磷酸化活性均沒有明顯改變。 siRNA2轉(zhuǎn)染入MDCK細(xì)胞48h后，MDCK細(xì)胞中的GlyRαl的蛋白表達(dá)水平明顯下降達(dá)60％以上，達(dá)到實(shí)驗(yàn)的要求。處于ATP耗竭狀態(tài)1h后，Wester

6、n blot顯示正常組和空轉(zhuǎn)組中，Gly保護(hù)組與ATP耗竭組相比，ERK1/2、AKT的磷酸化活性增強(qiáng)，p38MAPK的磷酸化活性減弱，JNK1/2的磷酸化活性沒有變化；而在干擾組中，Gly保護(hù)組與ATP耗竭組細(xì)胞相比ERK1/2、p38MAPK、JNK1/2和AKT的磷酸化活性均無明顯變化。 結(jié)論： ERK1/2、p38MAPK、AKT是甘氨酸受體細(xì)胞保護(hù)作用的下游途徑。甘氨酸與Glyg結(jié)合以后，通過增加ERK1/2、