王鏡巖生物化學(xué)教程2008版dna的重組

1、,,DNA的重組,第35章,(一) Holliday模型,一、同源重組,(二) 細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,細(xì)菌的結(jié)合作用,致育因子（F因子）通過(guò)結(jié)合作用由F+細(xì)胞向F-細(xì)胞轉(zhuǎn)移，F(xiàn)質(zhì)粒約1/3的基因與轉(zhuǎn)移有關(guān)，traS和traT基因編碼表面排斥蛋白，阻止F+細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)移，F(xiàn)+細(xì)胞的性菌毛與F-細(xì)胞結(jié)合后收縮，使二者靠近，TraD蛋白構(gòu)成轉(zhuǎn)移的通道，在TraI在TraY的幫助下結(jié)合到轉(zhuǎn)移起點(diǎn)oriT上，切開一條鏈，使其5?端進(jìn)入受體細(xì)胞

2、，并合成其互補(bǔ)鏈，使F-細(xì)胞轉(zhuǎn)化為F+細(xì)胞，給體細(xì)胞中的單鏈也可以合成互補(bǔ)鏈。,在細(xì)菌基因轉(zhuǎn)移的不同時(shí)間將配對(duì)細(xì)胞分開，可以確定基因在染色體上的位置。F質(zhì)粒DNA可以通過(guò)重組整合到受體的染色體中，使受體菌成為高頻重組（Hrf)菌株，若F質(zhì)粒的DNA未能完整地進(jìn)入受體菌，則受體菌不能轉(zhuǎn)化為F+, F質(zhì)粒的DNA可以被切割出來(lái)，有時(shí)可攜帶宿主菌的染色體DNA，稱作F?因子， F?因子攜帶的基因可在受體菌表達(dá)。,大腸桿菌染色體的基因圖,外源基

3、因可以進(jìn)入感受態(tài)細(xì)菌，稱作轉(zhuǎn)化，自然條件下感受態(tài)的形成需要10多種蛋白質(zhì)參與，實(shí)驗(yàn)室常用高濃度的Ca2+處理使細(xì)菌形成感受態(tài)。 通過(guò)噬菌體將細(xì)菌基因從供體菌轉(zhuǎn)移到受體菌稱作轉(zhuǎn)導(dǎo)，若宿主菌任意部位的基因取代噬菌體DNA的一部分轉(zhuǎn)入受體菌，稱作普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)，若宿主整合部位的DNA取代了噬菌體的部分DNA稱作限制性轉(zhuǎn)導(dǎo)。進(jìn)入受體菌的基因可與染色體重組。 用溶菌酶除去細(xì)菌的細(xì)胞壁，人工促使原生質(zhì)體融合，可引起廣泛的重組。,噬菌體的

4、基因重組,(三) 重組有關(guān)的酶,依賴RecBCD起始的重組模型: RecBCD有依賴ATP的核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶和解螺旋酶活性，當(dāng)DNA斷裂時(shí)，它結(jié)合在其游離端，使其解旋并降解，直至酶移動(dòng)到chi位點(diǎn)（GCTGGTGG)，在其3＇側(cè)4-6核苷酸處將鏈切斷，產(chǎn)生3＇游離單鏈，隨后單鏈與RecA結(jié)合，開始同源區(qū)重組。,RecA蛋白的絲狀聚合體與DNA的相互作用,RecA蛋白的帶狀圖解,RecA蛋白的絲狀聚合體，每一圈螺旋由6個(gè)R

5、ecA蛋白單體構(gòu)成，其中一個(gè)單體由紅色標(biāo)出。,RecA蛋白引起DNA同源重組的模型,在大腸桿菌中由RuvA,RuvB和RuvC蛋白參與的同源重組。 （a） RuvA四聚體的圖解。四個(gè)亞基形成的結(jié)構(gòu)像四個(gè)花瓣的花。 （b） RuvA/RuvB的作用： （左）RuvA四聚體結(jié)合到Holliday位點(diǎn)； （中）RuvB六聚體結(jié)合到雜合雙螺旋的兩對(duì)面，DNA穿過(guò)其中心， RuvB六聚體的作用像馬達(dá)，促進(jìn)超螺旋分叉

6、點(diǎn)通過(guò)復(fù)合體移動(dòng)。 （右）RuvC結(jié)合到Holliday位點(diǎn)，由其核酸酶活性切斷核酸鏈，切割位點(diǎn)由剪切體辨認(rèn)。 （c） RuvA四聚體的電荷分布，藍(lán)色表示正電荷，紅色表示負(fù)電荷，注意正電荷位于四聚體的表面，有四個(gè)負(fù)電荷區(qū)域位于其中心。 （d） 假設(shè)的RuvA四聚體與Holliday位點(diǎn)結(jié)合的結(jié)構(gòu)模型。,二、特異位點(diǎn)重組,細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組,沙門氏菌兩種鞭毛蛋白表達(dá)的調(diào)控,免疫球蛋白基因的重組,IgG的分子結(jié)構(gòu),（

7、1）,（2）,（3）,（4）,（5）,重組位點(diǎn)有7和9nt的信號(hào)序列,中間間隔12或23bp。,免疫球蛋白基因重組的模型,重組酶（RAC1/RAC2)復(fù)合體與重組信號(hào)序列結(jié)合,復(fù)合體使編碼序列與重組信號(hào)序列之間的雙連斷裂，編碼序列的末端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。,重組信號(hào)序列結(jié)合形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。,編碼序列連接前經(jīng)過(guò)加工，連接位點(diǎn)不十分確定，增加了免疫球蛋白的多樣性。,DNA依賴性蛋白激酶(DNA-PK)和DNA連接酶參與了加工和連接過(guò)程。,9堿基序列

8、,7堿基序列,在不同的核苷酸位點(diǎn)重組可以生成不同的蛋白質(zhì),三、轉(zhuǎn)座重組,McClintock的重要發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)座子具有反向末端重復(fù)序列以及在靶部位兩側(cè)產(chǎn)生的同向重復(fù)序列。在該例中靶序列為5bp，轉(zhuǎn)座子末端由9bp反向重復(fù)序列組成，數(shù)字1-9指序列重復(fù)堿基對(duì)。,*兩側(cè)正向重復(fù),*,**末端反向重復(fù),**,(一) 細(xì)菌的轉(zhuǎn)座因子1.插入因子,2.組合型轉(zhuǎn)座子：兩個(gè)插入序列之間夾著一段序列（可以是某個(gè)基因，如抗性基因）。兩個(gè)插入序列可以同向或

9、反向排列，有時(shí)均有轉(zhuǎn)座活性，有時(shí)只有一個(gè)有轉(zhuǎn)座活性。,3.復(fù)合型轉(zhuǎn)座子：插入序列被轉(zhuǎn)座酶基因取代，圖示為Tn3(TnA家族）的結(jié)構(gòu)。兩端為38bp的反向重復(fù)，其兩側(cè)為5bp的靶序列，tnpA編碼轉(zhuǎn)座酶，tnpR編碼的蛋白質(zhì)可以作為解離酶（使轉(zhuǎn)座子與受體DNA形成的共整合體重組和解離），也可以作為阻遏蛋白調(diào)節(jié)tnpA和tnpR兩個(gè)基因的表達(dá)，res為解離的控制位點(diǎn)，TnpR蛋白結(jié)合于其上發(fā)揮調(diào)控作用。,兩個(gè)IS10組件構(gòu)成一個(gè)復(fù)合轉(zhuǎn)座子，

10、它能使位于他們之間的任何DNA易位。當(dāng)Tn10是一個(gè)小的圓形分子的一部分時(shí)，IS10重復(fù)序列可轉(zhuǎn)座至環(huán)狀分子的任一側(cè)。,4.轉(zhuǎn)座的方式　　轉(zhuǎn)座子可用不同的方式轉(zhuǎn)座，轉(zhuǎn)座因子插入基因后可使基因失活，也可引起染色體的斷裂、重復(fù)、缺失、倒位、易位等變化。,插入序列使靶序列的數(shù)量增加，在插入序列兩側(cè)各有一個(gè)。,復(fù)制轉(zhuǎn)座作用產(chǎn)生了轉(zhuǎn)座子的一個(gè)拷貝，它插入到一個(gè)接受位點(diǎn)。給予位點(diǎn)保持不變，以致給予者和接受者都有轉(zhuǎn)座子的一個(gè)拷貝。,非復(fù)制轉(zhuǎn)座作用在

11、未被修復(fù)的情況下，可能造成致死突變。,保守的轉(zhuǎn)座作用不造成核苷酸的丟失，如λ噬菌體的整合和切除。,轉(zhuǎn)座子引起DNA的重排，正向重復(fù)序列的重組引起其間序列的切除或插入。,反向重復(fù)序列的重組能引起其間序列反向排列。,轉(zhuǎn)座作用可引起給體和受體的整合或分割，并可引起轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的增加,(二) 真核生物的轉(zhuǎn)座因子 原核生物的轉(zhuǎn)座酶主要作用于產(chǎn)生它的轉(zhuǎn)座因子，表現(xiàn)出順式顯性。真核生物的轉(zhuǎn)座酶可以作用于任何末端具有該酶所識(shí)別的反向重復(fù)順序

12、的DNA,使其轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的靶位點(diǎn)。 在玉米的激活-解離系統(tǒng)（activator-dissociation system, Ac-Ds)中，Ac編碼轉(zhuǎn)座酶(自主因子)，Ds（非自主因子）是Ac不同程度的缺失中間序列形成的，無(wú)轉(zhuǎn)座酶活性，但隨Ac轉(zhuǎn)座后可抑制鄰近基因的表達(dá)。 在玉米的抑制-促進(jìn)-增變系統(tǒng)（suppressor-promotor-mutator,Smp)中,Smp和En（增強(qiáng)子）序列相似，均為自主因子，與其對(duì)應(yīng)

13、的非自主因子dSmp為有缺陷的Smp因子，轉(zhuǎn)座后，若Smp插入靶基因附近的合適部位，可以促進(jìn)靶位點(diǎn)基因的表達(dá)，若Smp插入外顯子，可抑制基因的表達(dá)。,玉米的控制元件形成轉(zhuǎn)座子的不同家族，每個(gè)家族均有自主和非自主成員。,P品系的果蠅含有40-50個(gè)P因子（一種轉(zhuǎn)座子）， P因子的mRNA前體含有3個(gè)內(nèi)含子，若P品系雄性與M品系雌性交配，子一代的體細(xì)胞mRNA前體加工時(shí)保留了第3個(gè)內(nèi)含子，合成阻遏蛋白，不發(fā)生轉(zhuǎn)座，性細(xì)胞mRNA前體加工時(shí)切

14、除了全部3個(gè)內(nèi)含子，活躍的轉(zhuǎn)座使性細(xì)胞失去功能。P雄性或M雄性與P雌性交配時(shí)，由于雌性的卵細(xì)胞質(zhì)中存在抑制P因子轉(zhuǎn)座酶活性的蛋白質(zhì)，子代的生殖功能正常。,四、真核生物基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄前調(diào)控 1.染色體丟失:如四膜蟲的大核為營(yíng)養(yǎng)核，由小核發(fā)育而來(lái)，約10%的DNA在發(fā)育過(guò)程中被丟失。 2.基因擴(kuò)增：如非洲爪蟾卵母細(xì)胞的rDNA可以大量擴(kuò)增，形成1000個(gè)以上的核仁。 3.基因重排:重排可以使表達(dá)的基因發(fā)生切換

15、，也可以產(chǎn)生新的基因。 4.組蛋白的乙酰化和去乙?；航M蛋白的乙?；突虮磉_(dá)的狀態(tài)相關(guān)。組蛋白H4的乙?；蛔?underacetylation)是雌性哺乳動(dòng)物一條X染色體失活的原因之一。去乙酰化和基因活性的阻遏有關(guān)。 5.染色體DNA的修飾和異染色質(zhì)化：DNA的甲基化可以使其失去轉(zhuǎn)錄活性，高度甲基化的DNA可以形成高度壓縮的異染色質(zhì)，異染色質(zhì)的基因無(wú)轉(zhuǎn)錄活性。,6.染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變模型-組蛋白置換 占先

16、模型(pre-emptive model)：決定的因素是轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白誰(shuí)先占據(jù)調(diào)控位點(diǎn)。DNA復(fù)制時(shí)，組蛋白8聚體解離，轉(zhuǎn)錄因子乘機(jī)結(jié)合到調(diào)控位點(diǎn)上，一直持續(xù)到下一個(gè)復(fù)制周期，抑制了組蛋白和DNA的結(jié)合。 例1：當(dāng)5S rRNA基因與組蛋白結(jié)合時(shí)TFⅢA不能激活此基因。而TFⅢA可與游離的5S rRNA基因結(jié)合，再加入組蛋白不能使此基因失活。 例2：含腺病毒啟動(dòng)子的質(zhì)粒能被TFⅡD結(jié)合，再被RNA pol Ⅱ轉(zhuǎn)錄，如

17、先加入組蛋白，則不起始轉(zhuǎn)錄，如先加入TFⅡD則形成的染色質(zhì)中，模板仍能轉(zhuǎn)錄。 動(dòng)態(tài)模型(dynamic model) ：組蛋白置換需輸入能量。一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA時(shí)可裂解核小體，或建立一個(gè)可產(chǎn)生核小體定位結(jié)合位點(diǎn)的邊界。如果蠅Hsp70啟動(dòng)子上的核小體在體外實(shí)行重建。GAGA(細(xì)胞核結(jié)合蛋白)轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子中4個(gè)富含(CT)n位點(diǎn)結(jié)合，破壞了核小體，形成一高敏感區(qū)，而且導(dǎo)致鄰接的核小體重排，這樣它們就優(yōu)先插入到隨機(jī)位點(diǎn)。核小

18、體打開的過(guò)程是需要水解ATP的耗能過(guò)程。,7.細(xì)胞周期的調(diào)控 最關(guān)鍵的是兩個(gè)蛋白質(zhì)家族：周期素（cyclin)家族和依賴周期素的蛋白激酶（cyclin-depending protein kinase, CDK)家族,目前發(fā)現(xiàn)的周期素有10種以上，用字母A,B,C等表示， CDK有8種以上，用CDK1，CDK2，CDK3等表示。周期素A,周期素D, CDK2,CDK4的合成受轉(zhuǎn)錄因子E2F的調(diào)節(jié)，他們共同的作用控制著G1期向S

19、期的轉(zhuǎn)化，周期素A和周期素B與CDK2的結(jié)合對(duì)有絲分裂的啟動(dòng)是必要的。 新合成的促細(xì)胞分裂周期素與CDK結(jié)合，形成促M(fèi)期因子(M-phase promoting factor, MPF)，活化的CDK使自身的Y15和T161先后被磷酸化，隨后細(xì)胞周期基因（cell-division-cycle gene)的產(chǎn)物Cdc25將Y15的磷酸基水解，才使MPF活化，使許多靶蛋白磷酸化，導(dǎo)致有絲分裂開始?；罨闹芷谒?CDK復(fù)合物還可以激

20、活銷毀序列識(shí)別蛋白（destruction box recognizing protein, DBRP), DBRP與周期素的銷毀序列結(jié)合，隨后結(jié)合泛素，使周期素被蛋白酶體降解。,→使促M(fèi)期因子（MPF）活化,生長(zhǎng)因子受體與配體結(jié)合后，其酪氨酸蛋白激酶將一系列蛋白質(zhì)磷酸化，傳遞信號(hào)到細(xì)胞核，促進(jìn)細(xì)胞增殖或分化，如Ras蛋白可以激活促分裂原活化的蛋白激酶（mitoge-activated protein kinase，MAPK), MAP

21、K磷酸化細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)細(xì)胞增殖。有些生長(zhǎng)因子的受體無(wú)酪氨酸蛋白激酶活性，借助另外的激酶（just another kinase, JAK)及其底物(signal transducer and activator transcription, STAT)構(gòu)成的系統(tǒng)傳遞信號(hào)，受體-Ras-Ras和JAK-JAK兩個(gè)系統(tǒng)及其他系統(tǒng)之間存在相互作用。 最早發(fā)現(xiàn)的癌基因雞的肉瘤基因src是酪氨酸蛋白激酶的變體，它無(wú)需接受生長(zhǎng)信號(hào)，使