重組DNA疫苗治療大鼠脊髓損傷的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 傳統(tǒng)觀點認(rèn)為,成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nerve system,CNS)軸突損傷后不能再生,造成的功能缺失亦不可逆。近年研究表明,CNS損傷后,微環(huán)境中的軸突再生抑制因子抑制了神經(jīng)軸突的再生修復(fù)。目前已經(jīng)明確的軸突再生抑制因子有髓磷脂相關(guān)糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte-myelin gly

2、coprotein,OMgp)、腱糖蛋白(tenascin-R,TN-R)和Nogo-A。針對去除和中和軸突再生抑制因子從而促進(jìn)受損傷神經(jīng)軸突再生和功能修復(fù),成為神經(jīng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的焦點,并取得了一定進(jìn)展,但以往針對單一抑制因子的治療研究效果不十分理想。本課題組在前期研究工作中,構(gòu)建了一種編碼MAG、TN-R和Nogo-A的重組DNA疫苗,旨在最大程度中和相對關(guān)鍵的抑制因子、促進(jìn)CNS損傷后修復(fù)與再生。實驗表明,接種了這種重組DNA疫苗的

3、正常大鼠,可在其血清中檢測到特異性的重組融合蛋白抗體；對接受疫苗免疫的大鼠制作脊髓背側(cè)半橫斷損傷模型,可觀察到受損傷的皮質(zhì)脊髓束(corticospinal tract,CST)纖維獲得了長距離的再生。但是在臨床實踐中,任何針對脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)的治療實際上都是在損傷發(fā)生之后才得以進(jìn)行,而目前臨床上對于SCI的治療都是以盡可能保留殘余組織功能為宗旨、以進(jìn)一步減少副損傷并積極進(jìn)行康復(fù)治療為主要目標(biāo),尚

4、缺乏促進(jìn)CNS損傷后軸突再生的有效治療策略。
　　 為方便后續(xù)臨床治療研究,本課題組在原有DNA疫苗的基礎(chǔ)上、進(jìn)一步構(gòu)建了一種針對更多抑制因子功能位點的重組DNA疫苗,它編碼MAG的Ig1-5結(jié)構(gòu)域、TN-R的EGF-L結(jié)構(gòu)域、OMgp的FN結(jié)構(gòu)域、Nogo-A的N末端(Nogo-N)和66氨基酸胞外段(Nogo-66),并且采用腺病毒的骨架質(zhì)粒pAdEasy作為載體,以便在后續(xù)可能進(jìn)行的臨床實驗中包裝成腺病毒從而方便應(yīng)用。在本

5、實驗中,我們對這種全新的重組DNA疫苗進(jìn)行了免疫原性和安全性評估；并且以大鼠脊髓背側(cè)半橫斷損傷模型為研究對象,對該重組DNA疫苗在SCI后促進(jìn)CST纖維再生的治療效果進(jìn)行了綜合評價。
　　 第一部分 重組DNA疫苗的免疫原性和安全性研究
　　 目的：評估以腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy為載體,編碼CNS損傷后軸突再生抑制因子MAG的Ig1-5結(jié)構(gòu)域、TN-R的EGF-L結(jié)構(gòu)域、0Mgp的FN結(jié)構(gòu)域、Nogo-A的N末端(N

6、ogo-N)和66氨基酸胞外段(Nogo-66)的重組DNA疫苗之免疫原性和安全性。
　　 方法:以重組DNA疫苗連續(xù)肌肉注射、免疫5周齡Lewis大鼠8周[16只Lewis大鼠雌、雄各半,隨機分為DNA疫苗注射組(Vaccine組)和空質(zhì)粒注射組(pAdEasy組)兩組],1次/周,100μg/次；自第二周起,注射疫苗的同時自內(nèi)眥采血并獲取血清,點雜交(Dot-blot)及ELISA法對大鼠血清中特異抗體進(jìn)行定性和定量檢測。再

7、以重組DNA疫苗對8周齡雌性Lewis大鼠連續(xù)肌肉注射免疫12周(1次/周),觀察大鼠是否出現(xiàn)脫髓鞘病變的癥狀,取大鼠的脊髓組織,光鏡下觀察以固藍(lán)染色/甲酚紫染色及HE染色的脊髓組織,制作電鏡標(biāo)本和電鏡下觀察；同時以實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmuneencephalomyelitis,EAE)模型大鼠的脊髓組織為陽性對照,正常大鼠為陰性對照,評價是否有脫髓鞘病變的出現(xiàn)。
　　 結(jié)果:在接受疫

8、苗注射4周后,大鼠血清內(nèi)有針對融合蛋白的特異性抗體產(chǎn)生,6周后抗體效價可達(dá)到1:100萬；接受DNA疫苗免疫12周,大鼠從行為學(xué)上未見有自身免疫性腦脊髓膜炎的癥狀,視神經(jīng)、腦干和脊髓內(nèi)的皮質(zhì)脊髓束形態(tài)學(xué)上均與正常大鼠無異,未見脫髓鞘的病理改變。
　　 結(jié)論:本實驗條件下,編碼軸突生長抑制分子Nogo-A、OMgp、TN-R和MAG的重組DNA疫苗在接種大鼠后能夠產(chǎn)生特異性的抗體,有良好的免疫原性且并未出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變。

9、
　　 第二部分 重組DNA疫苗治療脊髓損傷的實驗研究
　　 目的：觀察重組DNA疫苗對脊髓背側(cè)半橫斷損傷模型大鼠的促皮質(zhì)脊髓束神經(jīng)軸突再生和功能修復(fù)療效。
　　 方法:8周齡雌性Lewis大鼠,體重200～220g,以2％戊巴比妥鈉40mg/Kg腹腔內(nèi)注射麻醉,虹膜咬除器切除第T8-9椎板制作大鼠脊髓背側(cè)半橫斷損傷模型。實驗動物依造模后治療方法的不同,隨機分為4組(每組8只):①VV組:DNA疫苗(DNA Va

10、ccine)+免疫血清(Anti-sera)；②VC組:DNA疫苗+對照血清(Control sera)；③CC組:空質(zhì)粒pAdEasy+對照血清；④Control組:制作模型后不予相關(guān)治療。手術(shù)時采用充滿了免疫血清的植入式膠囊滲透壓泵(MODEL,2ML4,2.5μL/h,28d),通過置于硬脊膜下的微導(dǎo)管以2.5μL/h的速度持續(xù)4周向鞘內(nèi)注入免疫血清；同時在損傷后即肌注DNA疫苗,100μg/次,1次/周,持續(xù)8周。治療對照組(即

11、VC組、CC組)分別以正常血清代替免疫血清,以沒有攜帶疫苗所編碼基因片段的pAdEasy質(zhì)粒代替DNA疫苗,給藥方式和時間相同。術(shù)后對大鼠依BBB評分進(jìn)行行為學(xué)檢測。在對模型動物取材前2周,大鼠用10％生物素萄聚糖胺(biotin dextran amine,BDA,MW 10,000)溶液緩慢注入雙側(cè)的感覺運動區(qū)皮質(zhì)內(nèi)進(jìn)行皮質(zhì)脊髓束追蹤,ABC法對生物素標(biāo)記的軸突進(jìn)行顯色。取以損傷灶為中心長為3mm新鮮脊髓組織進(jìn)行Western-bl

12、ot檢測,對TN-R、OMgp和生長相關(guān)蛋白(growth associated protein,GAP-43)進(jìn)行半定量測定。
　　 結(jié)果:制作脊髓背側(cè)半橫斷損傷模型并同步治療到第8周時,各組大鼠BBB評分的分值分別為:VV組,13.33±1.37:VC組,6.50±0.55；CC組,7.00±0.89；Control組,6.33±1.03。其中VV組的BBB評分與對照組相比增高有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)；脊髓背側(cè)半

13、橫斷損傷后8周,經(jīng)DNA疫苗和免疫血清聯(lián)合治療組(VV組)大鼠的皮質(zhì)脊髓束可見大量BDA陽性標(biāo)記的再生纖維穿過損傷灶,而VC,CC和Control組則幾乎未見有纖維再生的跡象,標(biāo)記的纖維僅限于膠質(zhì)瘢痕部位的近端。VV組每張切片上計數(shù)的BDA陽性標(biāo)記再生軸突的平均數(shù)量(6.69±1.76)與Control組(1.02±1.06)相比,增多有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。Western-blot檢測結(jié)果表明,損傷處的TN-R和OMgp