重組百日咳DNA疫苗實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文將第二代疫苗技術(shù)和第三代疫苗技術(shù)相結(jié)合，以基因工程方法研究重組百日咳DNA疫苗的免疫效果。首先，選取百日咳鮑特菌的免疫保護(hù)性抗原百日咳毒素S1亞基PTS1、粘著素PRN和絲狀血凝素FHA的基因片段。用基因工程的方法，先將PTS1的9位和129位氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)誘變，再將PTS1、PRN、FHA基因片段相連接，得到融合DNA片段PTS1-PRN-FHA(PPF)。將該融合片段重組到真核表達(dá)載體pVAX1中，同時(shí)將PTS1、PRN、FHA

2、各片段分別重組到真核表達(dá)載體pVAX1中。以融合質(zhì)粒(融合組)和混合的三種質(zhì)粒(混合組)免疫小鼠，檢測發(fā)現(xiàn)融合組和混合組均誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體抗PTS1、抗PRN、抗：FHA，并同時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-10、IL-4、IFNγ和TNF-α，顯示融合質(zhì)粒與混合質(zhì)粒一樣，能誘導(dǎo)小鼠的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。本研究應(yīng)用以下三種方法，探討改善重組百日咳疫苗免疫效應(yīng)的策略。一，在初次免疫時(shí)合并注射重組粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF質(zhì)粒；二，初

3、次免疫時(shí)合并注射重組GM-CSF質(zhì)粒，并以原核表達(dá)的重組百日咳抗原片段蛋白進(jìn)行加強(qiáng)免疫；三，將重組的百日咳抗原片段基因引入腺病毒載體，探討其免疫效應(yīng)。 首次將GM-CSF質(zhì)粒用于重組百日咳DNA疫苗研究。結(jié)果顯示，與單純DNA質(zhì)粒組相比，合并注射GM-CSF質(zhì)粒的小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的抗PTS1、IL-4和TNF-α，說明在初次免疫的時(shí)候合并免疫GM-CSF質(zhì)粒能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)小鼠的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。在用致死量的百日咳鮑特菌進(jìn)行腦腔攻擊

4、的實(shí)驗(yàn)中，單純DNA質(zhì)粒組、合并GM-CSF質(zhì)粒組對(duì)致死量腦腔百日咳鮑特菌攻擊均有一定的保護(hù)作用，但兩組的保護(hù)率沒有顯著性差異。 首次提出以GM-CSF質(zhì)粒合并DNA疫苗進(jìn)行初次免疫，并以DNA疫苗相應(yīng)的重組蛋白進(jìn)行加強(qiáng)免疫的策略。結(jié)果顯示，與單純DNA疫苗組比較，初次免疫時(shí)無論有無GM-CSF質(zhì)粒參與，重組蛋白加強(qiáng)免疫的實(shí)驗(yàn)組小鼠均誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著增多的抗PTS1、抗PRN、抗FHA抗體，這說明以重組蛋白加強(qiáng)免疫能夠極顯著增強(qiáng)．D

5、NA疫苗誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)。而與單純DNA疫苗組相比，合并GM-CSF質(zhì)粒初次免疫、重組蛋白加強(qiáng)免疫組小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗PTS1、抗PRN、抗FHA、IL-10、IL-4、IFN-γ和TNF-α均顯著增多。在特異性脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，GM-CSF質(zhì)粒初次免疫、重組蛋白加強(qiáng)免疫組小鼠還誘導(dǎo)產(chǎn)生了更強(qiáng)的脾細(xì)胞特異性增殖反應(yīng)。這顯示與單純合并GM-CSF質(zhì)粒初次免疫以及DNA初次免疫、重組蛋白加強(qiáng)免疫策略相比，合并GM-CSF質(zhì)粒初次免疫、重組蛋

6、白加強(qiáng)免疫的策略能誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)小鼠產(chǎn)生更強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，合并細(xì)胞因子初次免疫并以重組蛋白進(jìn)行加強(qiáng)免疫是改善DNA疫苗免疫反應(yīng)的有效策略，值得進(jìn)一步的研究和優(yōu)化。 試圖將重組百日咳抗原片段導(dǎo)入腺病毒載體。以病毒作為載體的疫苗有其自身的優(yōu)越性，可能產(chǎn)生更高的蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。試圖通過穿梭質(zhì)粒pShuttleCMV將百日咳抗原片段融合基因重組入腺病毒載體，在AD293細(xì)胞組裝后感染動(dòng)物，探討其誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫反

7、應(yīng)。本部分基于腺病毒載體的重組百日咳疫苗正在研究之中。盡管百日咳疫苗已經(jīng)應(yīng)用了近一個(gè)世紀(jì)，但百日咳引起的健康和經(jīng)濟(jì)問題并未解決，甚至有更加嚴(yán)重的趨勢。DNA疫苗已在多種感染性病原體和多種動(dòng)物模型中證實(shí)能誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，本研究證明DNA疫苗也可能成為應(yīng)對(duì)百日咳的候選疫苗。 DNA疫苗目前存在的問題是在大動(dòng)物誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)強(qiáng)度和對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用有限，增強(qiáng)DNA疫苗免疫反應(yīng)的各種策略是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)課題，本研究提出的增強(qiáng)D