Cj致Hartley豚鼠周圍神經(jīng)病模型——百日咳毒素劑量范圍及灌喂頻率的探索性研究.pdf

1、第一部分、0.1μg～20μg范圍的百日咳毒素與Cj致Hartley豚鼠周圍神經(jīng)纖維病變率沒(méi)有劑量依賴關(guān)系
　　目的：百日咳毒素可促進(jìn)空腸彎曲菌致Hartley豚鼠周圍神經(jīng)病變模型的形成，但是劑量范圍尚不清楚，觀察0.1μg～20μg的百日咳毒素對(duì)空腸彎曲菌（Campylobacter jejune，Cj）致Hartley豚鼠周圍神經(jīng)纖維病變率的影響。
　　方法：
　　1.制備菌懸液：從空腸彎曲菌菌株庫(kù)中選取lulei

2、株作為實(shí)驗(yàn)菌株，用哥倫比亞血培養(yǎng)基于42℃，10％CO2、5%O2、85%N2條件培養(yǎng)空腸彎曲菌。純化菌種，制備3×108cfu/ml菌懸液,準(zhǔn)備為Hartley豚鼠灌胃。
　　2.制備百日咳毒素注射液：在百日咳毒素粉劑（50μg）中加入50μl蒸餾水，備以配制不同濃度的PT注射液，準(zhǔn)備為Hartley豚鼠腹腔注射。
　　3.實(shí)驗(yàn)分組：將12只SPF級(jí)4周齡Hartley豚鼠隨機(jī)分為5組實(shí)驗(yàn)組和1組對(duì)照組，每組2只，實(shí)驗(yàn)組分

3、為：A組：0.1μg百日咳毒素+3×108cfu/ml Cj菌懸液；B組：1μg百日咳毒素+3×108cfu/ml Cj菌懸液；C組：2μg百日咳毒素+3×108cfu/ml Cj菌懸液；D組：10μg百日咳毒素+3×108cfu/ml Cj菌懸液；E組：20μg百日咳毒素+3×108cfu/mlCj菌懸液。對(duì)照組F組為空白對(duì)照組。
　　4.攻毒方案：攻毒前Hartley豚鼠禁食15h，禁水3h，實(shí)驗(yàn)組各組豚鼠用相應(yīng)劑量的PT注射

4、液腹腔注射，次日各實(shí)驗(yàn)組豚鼠給予空腸彎曲菌lulei株3×108cfu/ml菌懸液口服灌喂，2ml/只。攻毒結(jié)束后半小時(shí)給食水。各實(shí)驗(yàn)組均攻毒一次。
　　5.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的臨床癥狀觀察及解剖取材：自灌喂當(dāng)日起每日觀察豚鼠的肢體活動(dòng)、精神狀況、飲食、皮毛、糞便等情況。臨床癥狀參考Hartley豚鼠EAN模型的癱瘓?jiān)u分標(biāo)準(zhǔn)[1]：將癱瘓程度分為0～5級(jí)，0級(jí)：無(wú)異常；1級(jí)：兩后肢腳趾輕微拖拽地面；2級(jí)：兩后肢腳趾較明顯拖地，但未累及其他部

5、位；3級(jí)：兩后肢顯著拖地，常見(jiàn)兩后肢偏向同一側(cè)；4級(jí)：兩后肢完全癱瘓；5級(jí)：四肢肢體活動(dòng)均受累，甚至出現(xiàn)呼吸抑制。
　　于攻毒結(jié)束后4周取材，每組取一只豚鼠深度麻醉后活體取材，取左側(cè)坐骨神經(jīng)浸于4%的多聚甲醛中固定后鋨酸染色，右側(cè)坐骨神經(jīng)做冰凍切片后進(jìn)行HE染色和Gomori染色。每組的另一只豚鼠經(jīng)4%的多聚甲醛灌注后取材，取雙側(cè)坐骨神經(jīng)保存于4%的多聚甲醛中用于鋨酸染色。
　　6.觀察神經(jīng)病理變化及統(tǒng)計(jì)分析：光學(xué)顯微鏡下觀

6、察坐骨神經(jīng)鋨酸染色、HE染色及Gomori染色的病理結(jié)果。體式顯微鏡下每只豚鼠隨機(jī)分離100根神經(jīng)單根纖維，計(jì)算周圍神經(jīng)纖維病變率（周圍神經(jīng)纖維病變率=病變神經(jīng)單根纖維數(shù)/100×100%）。采用χ2分割法分析各組之間周圍神經(jīng)纖維病變率有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,采用χ2檢驗(yàn)，分析每組豚鼠活體取材和灌注后取材周圍神經(jīng)纖維病變率，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析。
　　結(jié)果：
　　1.豚鼠的臨床癥狀：對(duì)照組豚鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中精神、飲食均可，且未出現(xiàn)肢

7、體活動(dòng)障礙現(xiàn)象及皮毛較臟等異常現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)組豚鼠于注射百日咳毒素后當(dāng)天精神、食欲稍差，其中D組8號(hào)豚鼠注射PT后右下肢運(yùn)動(dòng)能力明顯減退，不能站立，根據(jù)Hartley豚鼠EAN模型評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)分2級(jí)，放回籠中觀察5min，運(yùn)動(dòng)能力明顯好轉(zhuǎn)，可站立，觀察30min，運(yùn)動(dòng)能力恢復(fù)正常，評(píng)分0級(jí)。次日，實(shí)驗(yàn)組豚鼠精神、食欲恢復(fù)正常。實(shí)驗(yàn)組豚鼠于注射百日咳毒素后第二天灌喂空腸彎曲菌，E組6號(hào)豚鼠自灌喂結(jié)束后17天腹部出現(xiàn)皮毛較臟現(xiàn)象。其余實(shí)驗(yàn)組豚鼠

8、未出現(xiàn)肢體活動(dòng)障礙、皮毛較臟等異?，F(xiàn)象；
　　2.神經(jīng)病理觀察：
　　2.1 鋨酸染色觀察：實(shí)驗(yàn)組豚鼠坐骨神經(jīng)出現(xiàn)髓鞘脫失、斷裂、聚集成塊狀，部分軸索被壓迫，軸索粗細(xì)不等，郞飛氏結(jié)處板層疏松，結(jié)旁區(qū)皺縮呈城墻樣改變，郞飛氏結(jié)處蟲(chóng)蝕樣改變，郞飛氏結(jié)增寬。對(duì)照組豚鼠坐骨神經(jīng)郞飛氏結(jié)無(wú)增寬，髓鞘、軸索光滑。
　　2.2 實(shí)驗(yàn)組HE染色觀察：軸索粗細(xì)不等，部分軸索斷裂，髓鞘呈大小不一、程度不等的空泡樣變。
　　2.3 實(shí)

9、驗(yàn)組Gomori染色觀察：部分軸索斷裂、粗細(xì)不等，髓鞘呈不同程度、不同部位的空泡樣變；
　　3.鋨酸染色后各組周圍神經(jīng)病變率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果：各組Hartley豚鼠周圍神經(jīng)纖維病變率如下：A（0.1μg）組為12.5%，B（1μg）組為22.5%，C（2μg）組為23%，D（10μg）組為19.5%，E（20μg）組為22%，F(xiàn)（0μg）組為2.5%。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用χ2分割法對(duì)各組之間的周圍神經(jīng)纖維病變

10、數(shù)進(jìn)行雙側(cè)性顯著檢驗(yàn)，校正檢驗(yàn)水準(zhǔn)，α的校正值為0.0033，得出F組與A～E各組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，A～E各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。采用χ2檢驗(yàn)對(duì)各組組內(nèi)豚鼠坐骨神經(jīng)纖維的病變數(shù)進(jìn)行雙側(cè)性顯著檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05，得出各組活體取材和灌注后取材周圍神經(jīng)纖維病變率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　1.空腸彎曲菌聯(lián)合百日咳毒素可以導(dǎo)致Hartley豚鼠周圍神經(jīng)的損傷。
　　2.0.1μg～20μg范圍的百日咳毒素用量與H

11、artley豚鼠的周圍神經(jīng)纖維病變率沒(méi)有劑量依賴關(guān)系。
　　第二部分、灌喂頻率的改變對(duì)Cj致Hartley豚鼠周圍神經(jīng)病模型的影響觀察
　　目的：探索空腸彎曲菌致Hartley豚鼠周圍神經(jīng)病模型的最佳灌喂頻率，改良造模方案。
　　方法：
　　1.制備菌懸液：從空腸彎曲菌菌株庫(kù)中選取lulei株作為實(shí)驗(yàn)菌株，用哥倫比亞血培養(yǎng)基于42℃，10%CO2、5%O2、85%N2條件培養(yǎng)空腸彎曲菌。純化菌種，制備3×108c

12、fu/ml菌懸液。
　　2.實(shí)驗(yàn)方法：將32只SPF級(jí)4周齡Hartley豚鼠隨機(jī)分為2組實(shí)驗(yàn)組和1組對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組每組12只，對(duì)照組8只。實(shí)驗(yàn)組分為：A組：每隔2天攻毒一次，連續(xù)攻毒7次，攻毒后每5天解剖3只。B組：每隔1天攻毒一次，連續(xù)攻毒10次，攻毒后每5天解剖3只。攻毒方法為空腸彎曲菌lulei株3×108cfu/ml菌懸液口服灌喂豚鼠，2ml/只，灌喂前Hartley豚鼠禁食15小時(shí)，禁水3小時(shí)，灌喂后半小時(shí)給食水。對(duì)照

13、組C組為空白對(duì)照，分批次與實(shí)驗(yàn)組同期解剖，每批解剖2只。
　　3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臨床癥狀、病理觀察及統(tǒng)計(jì)分析：自灌喂當(dāng)日起每日觀察豚鼠的肢體活動(dòng)、飲食、體重、皮毛、大便的情況（豚鼠的癱瘓?jiān)u分評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考第一部分 中文摘要 方法5）。于攻毒后按時(shí)間點(diǎn)解剖取材，取坐骨神經(jīng)進(jìn)行鋨酸染色，每只豚鼠隨機(jī)分離100根神經(jīng)單絲，觀察豚鼠的周圍神經(jīng)纖維病變情況，統(tǒng)計(jì)每組豚鼠周圍神經(jīng)纖維病變數(shù)，計(jì)算周圍神經(jīng)纖維病變率（周圍神經(jīng)纖維病變率=病變神經(jīng)單根纖維

14、數(shù)/100×100%）。采用χ2分割法對(duì)各組之間以及各組組內(nèi)不同解剖批次之間的周圍神經(jīng)纖維病變率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析。
　　結(jié)果：
　　1.豚鼠的臨床癥狀：對(duì)照組豚鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中精神、飲食均可，且未出現(xiàn)肢體活動(dòng)障礙現(xiàn)象及脫毛、皮毛較臟等異?，F(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)組豚鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中精神、飲食均可，肢體活動(dòng)自如，其中B組16號(hào)、79號(hào)豚鼠于末次攻毒后5天出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象，79號(hào)豚鼠于攻毒結(jié)束后18天皮毛恢復(fù)正常，16號(hào)豚鼠至解剖日皮毛未恢

15、復(fù)正常；
　　2.神經(jīng)病理觀察：
　　2.1 鋨酸染色：實(shí)驗(yàn)組豚鼠坐骨神經(jīng)纖維出現(xiàn)髓鞘斷裂聚集成塊狀，部分軸索被壓迫，郞飛氏結(jié)結(jié)旁區(qū)皺縮呈城墻樣改變，郞飛氏結(jié)處蟲(chóng)蝕樣改變。對(duì)照組豚鼠坐骨神經(jīng)纖維郞飛氏結(jié)無(wú)增寬，髓鞘、軸索光滑。
　　2.2 鋨酸染色后各組周圍神經(jīng)病變率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果：A組為24.17%，B組為25.83%， C組為3.125%。各組組內(nèi)四個(gè)解剖批次的周圍神經(jīng)病變率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果：A1為19.33%，A2為25.

16、67%，A3為26.67%，A4為25.00%，B1為21.33%， B2為25.00%，B3為26.67%，B4為30.33%，C1為3.5%，C2為2.5%， C3為3.0%，C4為3.5%。使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用χ2分割法分別對(duì)A、B、C三組組間的神經(jīng)病變情況進(jìn)行雙側(cè)性顯著檢驗(yàn)，α的校正值為0.0167，得出A、B組均與C組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，A組和B組之間的無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；對(duì)每組組內(nèi)各解剖批次的神經(jīng)纖維病變