百日咳桿菌氣管定植因子(TcfA)的功能分析.pdf

1、百日咳是由百日咳鮑特氏菌(以下簡稱百日咳桿菌)引起的一種呼吸道傳染病,在嬰幼兒當(dāng)中較為常見。百日咳桿菌致病機(jī)理包括粘附、侵襲、產(chǎn)毒等一系列的過程。絲狀血凝素(Filamentous hemagglutmin)、粘附素(Pertactin)、百日咳氣管定植因子(Tracheal colonization factor; TcfA)等諸多膜表面蛋白參與到細(xì)菌的粘附過程。百日咳氣管定植因子是百日咳桿菌膜表面蛋白,相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,推測(cè)該蛋白可能是

2、百日咳桿菌的粘附分子,但對(duì)其粘附功能尚未進(jìn)行系統(tǒng)的驗(yàn)證。因此本研究采用DNA重組技術(shù),在大腸桿菌(BL21;DE3)內(nèi)表達(dá)TcfA蛋白,并純化重組TcfA蛋白。然后通過重組表達(dá)菌的體外細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)、重組蛋白免疫熒光實(shí)驗(yàn)、競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)證明TcfA蛋白的黏附作用。并在此基礎(chǔ)上,就TcfA蛋白第317-319位RGD三聯(lián)肽的功能進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)通過構(gòu)建FHA-PRN-基因缺失株,探究TcfA蛋白在粘附過程中的重要性,并嘗試找出TcfA蛋白與經(jīng)典

3、模型細(xì)胞HeLa相互作用的受體。
　　通過基因重組技術(shù)成功的表達(dá)了TcfA蛋白,并純化出純度達(dá)85％的重組蛋白,免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,重組蛋白能與疫苗生產(chǎn)菌株(CS菌)全菌體血清發(fā)生抗原抗體反應(yīng),說明重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性和抗原特異性;玻片凝集實(shí)驗(yàn)和V管凝集實(shí)驗(yàn)證明TcfA蛋白表達(dá)于大腸桿菌膜表面;熒光粘附試驗(yàn)證實(shí)表達(dá)有TcfA的大腸桿菌與含有空載體的大腸桿菌對(duì)經(jīng)典模式細(xì)胞的粘附有明顯的差異,CFU實(shí)驗(yàn)定量證實(shí)兩者之間具有統(tǒng)

4、計(jì)學(xué)差異。粘附ELISA實(shí)驗(yàn)從另一技術(shù)方法反映了兩者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。重組蛋白的免疫熒光實(shí)驗(yàn)間接反映了 TcfA蛋白與細(xì)胞受體的相互作用,重組蛋白的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)表明TcfA蛋白能競(jìng)爭(zhēng)抑制重組TcfA大腸桿菌的粘附,并表現(xiàn)出蛋白濃度的依賴性。TcfA小鼠多抗封閉實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,封閉了重組大腸桿菌膜表面的TcfA蛋白,細(xì)菌的粘附率出現(xiàn)明顯的下降,說明了TcfA蛋白的粘附的特異性(依賴性)。含RGD的短肽與含RGE的短肽的競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)表明,T

5、cfA蛋白可能通過其氨基酸位點(diǎn)上的RGD模序發(fā)揮作用。慶大霉素胞外殺傷實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)病原菌是否具有入侵宿主細(xì)胞能力的有效方法之一,該方法主要是檢測(cè)粘附分子是否介導(dǎo)了病原菌的入侵。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TcfA蛋白并不介導(dǎo)重組大腸桿菌入侵HeLa細(xì)胞。FHA、PRN基因缺失株與抗TcfA小鼠多克隆抗體作用后,粘附力相比于FHA、PRN基因缺失株和CS野生株有較明顯的下降,說明TcfA蛋白作為百日咳桿菌膜表面的一個(gè)粘附因子,在細(xì)菌的粘附過程中發(fā)揮著重要