表皮神經(jīng)嵴干細胞移植治療大鼠脊髓損傷的實驗研究.pdf

1、目的:
　　建立綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)轉(zhuǎn)基因大鼠來源的表皮神經(jīng)嵴干細胞(epidermal neural crest stem cells，EPI-NCSCs)培養(yǎng)方法，為研究EPI-NCSC在移植修復(fù)脊髓損傷奠定基礎(chǔ);探討EPI-NCSCs移植對大鼠損傷脊髓的修復(fù)作用，以及對受體組織內(nèi)腦源性神經(jīng)生長因子（brain-derived neurotrophic factor，BDN

2、F）、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glialcell line-derived neurotrophic factor，GDNF)、Nogo-A表達的影響。
　　方法:
　　取GFP大鼠觸須墊毛囊，將毛囊隆突部放入用鼠尾膠原處理過的培養(yǎng)板上。培養(yǎng)第3d有細胞從毛囊隆突爬出，去除貼附的毛囊隆突部，胰酶重懸細胞并傳代培養(yǎng)，細胞使用Sox10以及Nestin免疫細胞化學(xué)

3、染色進行鑒定，測量EPI-NCSCs純度。
　　60只SD大鼠均暴露T10節(jié)段脊髓，并在NYU-Ⅱ撞擊機，以10g-25mm致傷力挫傷脊髓制作脊髓損傷(SCI)模型，隨機分為空白損傷組（A組）、DMEM移植組（B組）、表皮神經(jīng)嵴干細胞移植組（C組）。SCI模型大鼠損傷一周后將EPI-NCSCs細胞懸液移植入大鼠脊髓損傷處，DMEM組用單純的DMEM/F12代替，空白損傷組不做處理。移植術(shù)后第1周、2周、3周、4周、5周、6周根據(jù)B

4、BB(Basso-Beattie-Breanahan locomotor rating scale)評分細則評分。
　　移植術(shù)后1周，每組隨機取動物3只，取T10節(jié)段區(qū)脊髓組織約15 mm，抽提組織總蛋白，使用NGF、BDNF的酶聯(lián)免疫(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)試劑盒檢測各組脊髓組織內(nèi)NGF、BDNF的表達量。
　　移植術(shù)后3周，每組隨機取動物3只，取T10節(jié)段區(qū)脊髓組織

5、約15 mm，制成冰凍切片，使用免疫組化方法，檢測各組脊髓內(nèi)BDNF的表達，使用免疫熒光染色方法，檢測各組脊髓內(nèi)BDNF、Nogo-A的表達。取T10為中心脊髓組織15 mm，提取蛋白，采用NGF、BDNF的ELISA試劑盒檢測各組脊髓組織內(nèi)NGF、BDNF的表達量。采用Western blot方法檢測各組脊髓內(nèi)Nogo-A的表達。
　　移植術(shù)后6周，每組隨機取動物3只，取T10節(jié)段區(qū)脊髓組織約15 mm，制成冰凍切片，使用免疫組

6、化方法，檢測各組脊髓內(nèi)BDNF、GDNF、NGF的表達，使用免疫熒光染色方法，檢測各組脊髓內(nèi)BDNF、GDNF、NGF、Nogo-A的表達。取T10為中心脊髓組織15 mm，提取蛋白，使用NGF、BDNF的ELISA試劑盒檢測各組脊髓組織內(nèi)NGF、BDNF的表達量。使用Western blot方法檢測各組脊髓內(nèi)BDNF、Nogo-A的表達。使用實時熒光定量PCR方法，檢測各組脊髓內(nèi)GDNF的表達。
　　結(jié)果:
　　GFP大鼠

7、來源的EPI-NCSCs在熒光顯微鏡下均可觀察到有天然穩(wěn)定的亮綠色熒光。培養(yǎng)第3d細胞以隆突部為中心向外周伸展，剛爬出的細胞多呈卵圓形，隨后長出突起，細胞可見分裂象，呈啞鈴形。傳代培養(yǎng)的細胞形態(tài)多為圓形，也可見梭形和三角形。經(jīng)Sox10以及Nestin免疫熒光細胞化學(xué)染色鑒定，該方法培養(yǎng)出的EPI-NCSCs純度可在90％以上。
　　移植術(shù)后，各組大鼠后肢功能有所恢復(fù)，從第2周起C組大鼠雙下肢1-2個關(guān)節(jié)開始有輕微活動;移植術(shù)后4

8、周，C組大鼠常見雙下肢3個關(guān)節(jié)大幅活動;移植術(shù)后6周C組大鼠足底負重步行，A組和B組大鼠拖動后肢前行，足置于不負重位。C組大鼠的運動功能相對于其他兩組顯著提高。表明EPI-NCSCs移植可促進SCI大鼠運動功能的恢復(fù)。
　　移植術(shù)后1周，經(jīng)ELISA檢測，三組大鼠脊髓內(nèi)BDNF、NGF的表達量差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　移植術(shù)后3周，ELISA結(jié)果顯示，C組BDNF、NGF表達高于A組和B組(P＜0.05);經(jīng)免疫組化發(fā)現(xiàn)A組

9、和B組有少量細胞胞漿呈現(xiàn)NGF、BDNF棕黃色陽性染色，分布于脊髓的灰質(zhì)和白質(zhì)，而C組可見EPI-NCSCs及移植細胞周圍的脊髓組織呈大量棕黃色陽性反應(yīng);免疫熒光組織染色可見C組BDNF陽性細胞增多，表達量高于同期A、B兩組，同時，C組Nogo-A陽性細胞減少，表達量低于同期A、B兩組;經(jīng)Westernblot檢測，C組Nogo-A表達低于A組和B組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　移植術(shù)后6周，ELISA結(jié)果顯示，C組

10、BDNF、NGF表達持續(xù)升高，表達量同期A、B兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);經(jīng)免疫組化發(fā)現(xiàn)A組和B組有部分細胞胞漿呈現(xiàn)BDNF、GDNF、NGF棕黃色陽性染色，分布于脊髓的灰質(zhì)和白質(zhì)，而C組可見EPI-NCSCs及移植細胞周圍的脊髓組織呈大量棕黃色陽性反應(yīng);免疫熒光組織染色可見C組BDNF、GDNF、NGF陽性細胞增多，表達量高于同期A、B兩組，同時，C組Nogo-A陽性細胞比3周時表達更少，表達量低于同期A、B兩組;經(jīng)W

11、estern blot檢測，C組Nogo-A表達明顯低于A組和B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，同時，C組BDNF表達高于同期A組和B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);C組GDNFmRNA表達最強，高于同期A組和B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.本實驗培養(yǎng)的EPI-NCSCs來源于GFP轉(zhuǎn)基因大鼠，分離的細胞具有天然穩(wěn)定的綠色熒光標記，是研究EPI-NCSCs移植修復(fù)脊髓損傷作用機制的理