血栓與止血的篩選試驗及其臨床應(yīng)用

1、血栓與止血的篩選試驗及其臨床應(yīng)用,上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院王鴻利 王學鋒,迄今，檢測血栓與止血的試驗逾百種，大致可分為篩選試驗、確診試驗、排除試驗和基因分析等四大類。本文僅就篩選實驗，如出血時間（BT）、血小板計數(shù)（PLT），活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT），纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物（FDPs）、D-二聚體（D-D），血小板功能分析儀（PFA-100）、血栓彈力圖（TEG）的檢測其臨床應(yīng)用作一簡述。,圖1

2、 血管內(nèi)皮細胞與止血系統(tǒng),（一）一期出血缺陷篩檢試驗的應(yīng)用,1.一期止血缺陷 是指血管壁和血小板異常所引起的止血功能缺陷，主要是由于毛細血管壁通透性、脆性增加或血小板數(shù)量、質(zhì)量異常所致的出血。,2.臨床特點 出血以皮膚、黏膜為主，重者可伴有內(nèi)臟出血；但肌肉、關(guān)節(jié)等組織出血罕見。 對壓迫、縫合、外用止血劑或輸注血小板治療有效，但對血漿和血漿凝血因子制品無效。3.篩選試驗 出血時間（BT） 血小板計數(shù)（PLT）

3、,篩選試驗1.出血時間（BT，模板式刀片法/出血時間測定器法）反映毛細血管壁與血小板相互作用：毛細血管的完整性、收縮性以及血小板數(shù)量、功能的實驗。參考范圍：TBT法：6.9±2.1 min,臨床意義：BT延長（＞9.0min）（1）PLT↓與BT↑呈負相關(guān)，PLT愈↓BT愈↑。（2）血小板功能異常：血小板無力癥、巨血小板綜合征、灰色血小板綜合征等。（3）部分凝血因子缺乏：低/無纖維蛋白原血癥、血管性血友病（vWD）等

4、。（4）遺傳性出血性毛細血管擴張癥。（5）藥物：阿司匹林（ASA）、氯吡格雷（玻立維）和阿昔單抗等。,方法學評價 上海瑞金醫(yī)院對126例ITP和20例vWD患者檢測BT結(jié)果列于表1；對BT的三種方法比較見表2。 表1 ITP和vWD應(yīng)用兩種BT法檢測的結(jié)果,* P＜0.01,表2 三種BT檢測方法的比較,2.血小板計數(shù)（PLT） 單位容積的循環(huán)血液中所含血小板的數(shù)量 （×109/L ）

5、。方法：（1）直接血小板計數(shù)法（普通顯微鏡法/相差顯微鏡法）；（2）血液分析儀（電阻抗法/光散射法）；（3）流式細胞儀法。參考范圍：國內(nèi)：85～320 ×109/L （成人）；通常是100 ～300 ×109/L 。,臨床意義（1）血小板減少（＜100 ×109/L ）：PLT＞50 ×109/L ，出血少見；50～30 ×109/L，外傷性出血；＜20×109/L

6、 ，自發(fā)性出血，常需輸注血小板制品。 血小板減少原因：生成減少、破壞增多、消耗過多、分布異常等。（2）血小板增多（ ＞ 400 ×109/L ）：PLT400 ～600 ×109/L，需觀察；PLT ＞ 600 ×109/L，需治療； PLT＞ 600 ×109/L ，需血小板分離。血小板增多原因：骨髓增生性疾病、反應(yīng)性血小板增多。,方法學評價 ICSH推薦：一般用血涂片法觀察血小板分

7、布并與計數(shù)核實。（1）草酸胺稀釋-相差顯微鏡計數(shù)血小板；（2）流式細胞術(shù)計數(shù)。 經(jīng)國際11個實驗室用CD41、CD61驗證，該法準確度、精密度很好，可作為自動血細胞分析儀的校準和PLT減少的準確性的驗證。,圖 2 一期止血缺陷的篩選試驗,圖3 先天性初期止血異常的實驗室檢查,獲得性初期止血異常的實驗室檢查,（二）二期止血缺陷篩檢試驗的應(yīng)用,1.二期止血缺陷 是指凝血障礙和抗凝物質(zhì)所引起的止血功能缺陷，主要是由于凝血因子缺乏

8、或體內(nèi)產(chǎn)生病理性抗凝物質(zhì)所致出血。,2.臨床特點 出血以肌肉、關(guān)節(jié)為特點、也可有內(nèi)臟、皮膚出血 對血漿、血漿凝血因子制品有效，但對壓迫、外用止血劑和輸血小板療效欠佳。3.篩選試驗 活化部分凝血活酶時間（APTT） 血漿凝血酶原時間（PT）,圖 4 凝血系統(tǒng)及其篩選實驗,1.活化的部分凝血活酶時間（APTT） APTT是內(nèi)源凝血途徑的常用和較敏感的篩選試驗。參考范圍：傳統(tǒng)的是31～43s；目前隨著儀器和試

9、劑的開發(fā)，其參考值不一，尚難統(tǒng)一。正常對照值：傳統(tǒng)的須測對照值，以測定值較對照值延長＞10s為異常；目前也未統(tǒng)一。APTTR：患者APTT/正常對照APTT比值，尚未得出參考范圍，尚未推廣應(yīng)用。,臨床意義（1）內(nèi)源性凝血途徑因子缺陷：FⅧ（血友病A）、FⅨ（血友病B）、FⅪ、FⅫ、PK和HMWK等遺傳性缺乏癥。（2）內(nèi)源性凝血途徑因子抑制物存在：常見FⅧ、 FⅨ抑制物，狼瘡抗凝物（LA），應(yīng)選用鞣花酸為激活劑更敏感。（3）藥

10、物所致異常：常見肝素（患者APTT/正常人APTT比值為1.5～2.5為治療范圍）、輸注庫血引起凝血病等。（4）纖溶活性增強：尤其是多見于繼發(fā)性纖溶亢進（DIC），而原發(fā)性纖溶很少延長。,方法學評價（1）激活劑：白陶土、硅藻土和鞣花酸的敏感性比較，見表3 表 3 不同激活劑對APTT敏感度比較,（2）凝血時間檢測的敏感性比較：瑞金醫(yī)院對血友病患者凝血時間的敏感度作比較,延長率（%）：APTT 95%，硅管法CT100%

11、，ACT100%，而試管法CT為70%，故目前用APTT為篩選實驗簡單、方便、實用。,2、血漿凝血酶原時間（PT） PT是外源凝血系統(tǒng)常用和較為敏感的篩選實驗。參考范圍：傳統(tǒng)法為12 ± 1s（11～13s）；目前，隨著儀器和試劑不同，參考范圍也有不同。尚未統(tǒng)一。正常對照組：傳統(tǒng)法為測定值較正常對照組＞3s為異常，目前也未統(tǒng)一。PTR 參考范圍：1.00 ±0.05，已在應(yīng)用。,臨床意義（1）PT延長

12、：見于遺傳性/獲得性外源凝血系統(tǒng)的凝血因子缺乏；獲得性常見于DIC、依K因子缺乏、口服抗凝劑、肝??；循環(huán)血抗凝物質(zhì)：肝素、FDP、抗因子抗體。（2）PT-INR 多用于監(jiān)測口服抗凝劑（華法林）。INR＜1.5提示抗凝劑無效；INR 1.5～2. 0 用于預防；INR 2.0 ～2. 5 常規(guī)抗凝； INR2.5 ～3.0 重度抗凝；INR ＞3.0 易致出血。,方法學評價（1）Hct＜30%或＞50%，抗凝劑和血液的比例應(yīng)按下式調(diào)整

13、（表4）抗凝劑量（mL）=（100-Hct）×血液量（ mL） ×0.00185 表 4 Hct對PT和APTT測定結(jié)果的影響,,（2）凝血活酶（組織因子）：兔腦、人腦、重組組織因子（rTF）對PT的結(jié)果，不盡相同。 rTF ＞人腦＞兔腦（3）緩沖劑 其維持血漿pH，防止易變因子失活；如果無緩沖劑，血漿pH增加，PT延長。,（三）、篩選試驗的聯(lián)合應(yīng)用,主要是PT、APTT和PLT的聯(lián)合應(yīng)用。,1）PT（

14、N）、APTT和PLT（N）,2）PT（↑）、APTT（N）和PLT（N）,3）PT（↑）、APTT（↑）和PLT（N）,4）PT（↑）、APTT（↑）和PLT（↓）,5）PT（N）、APTT（N）和PLT（↑）,6）有出血癥狀，但PT（N），APTT（N）和PLT（N）,圖 3 先天性凝血異常的實驗室檢查,表 獲得性凝血性障礙項目的選擇和應(yīng)用,（四）纖溶活性增強篩選試驗的應(yīng)用,1、原發(fā)性纖溶性增強 指組織型纖溶酶原激活物（t-PA

15、）或尿激酶型纖溶酶原活物（u-PA）的活性增強所致纖溶性亢進2、繼發(fā)性纖溶活性增強 幾乎都見于DIC，是指因子Ⅻa激活激肽釋放酶原（PK）生成激肽釋放酶（KK），KK激活纖溶系統(tǒng)所致纖溶活性增強。,3、篩選試驗纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物（FDP）測定D-二聚體測定（D-D）,圖5 FDP和D-D的生成,1、纖維蛋白原（Fg）和纖維蛋白（Fb）降解產(chǎn)物（FDPs）測定 指纖溶酶同時降解Fg和Fb產(chǎn)生的FDPs。（1）定性試

16、驗：膠乳凝集法。陰性：血清FDP含量＜10μg/mL，血漿FDP含量＜5μg/mL，尿液FDP含量＜2μg/mL。陽性：血清FDP含量≥10μg/mL，血漿FDP含量≥ 5μg/mL，尿液FDP含量≥ 2μg/mL。,（2）定量試驗：ELISA法。包被于固相的FDP抗體與樣本中FDP（抗原）結(jié)合，加入酶標抗體后形成夾心復合物，呈顯色反應(yīng)。 參考值：＜5 μg/mL。,2、D-二聚體（D-D）測定 指纖溶酶特異性降解纖維蛋白

17、（Fb）所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物。（1）定性試驗：膠乳凝集試驗。陰性：無凝集顆粒者，即D-D含量＜0.5μg/mL陽性：有凝集顆粒者，即D-D含量≥0.5μg/mL半定量：以＜0.5μg/mL、 ≥0.5μg/mL×陽性時的最大稀釋倍數(shù)。,（2）定量試驗：ELISA法。 參考范圍： ＜0.5μg/mL（3）定量試驗：膠體金法。將血漿加入檢測卡孔內(nèi)，血漿中D-D吸附于包被有D-D單抗膜中，再加入D-D單抗-膠體金耦聯(lián)物

18、溶液，膜中D-D將與金標抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，用光筆閱讀儀讀數(shù)。 參考范圍： ＜0.3 mg/L,臨床應(yīng)用（1）纖溶活性增強篩檢試驗的應(yīng)用 FDP正常，D-D正常：多數(shù)為正常人，提示無纖溶過度現(xiàn)象。 FDP陽性，D-D正常：多數(shù)為FDP的假陽性或原發(fā)性纖溶癥。 FDP正常，D-D陽性：多數(shù)為FDP假陰性或繼發(fā)性纖溶癥。 FDP陽性，D-D陽性：多數(shù)為繼發(fā)性纖溶癥，常見于DIC。,（2）在診斷DIC中的應(yīng)用 見

19、表 5 表5 FDP和D-D在診斷DIC中的應(yīng)用,(3)D-D在排除靜脈血栓（VTE）中的應(yīng)用 D-D測定在排除VTE中有重要價值（表6）。 表 6 D-D測定在排除VTE中的應(yīng)用,方法學評價（1）對VTE的診斷：D-D測定有高度敏感性和陰性預測值，但特異性較低。因此，D-D測定陰性可排除VTE，陽性不一定是VTE。（2）D-D測定，WHO規(guī)定用ELISA法，臨界值為500 μg/L。因此D-D測定值＜500 μ

20、g/L排除VTE，幾乎為100%，＞ 500 μg/L診斷VTE的可能性為40%，必須結(jié)合其他影象檢查。,（3）D-D測定陰性時，結(jié)合臨床低/中危險度，其排除價值更大；D-D測定陽性時，結(jié)合臨床高危險度和影象檢查診斷價值更大。（4）FDP和D-D陽性可見于老年人、妊娠、癌腫、DIC、肝病、感染、炎癥、創(chuàng)傷、手術(shù)、溶栓治療、冠心病等。判斷結(jié)果時要充分考慮。,（五）DIC篩選試驗的應(yīng)用,診斷DIC必須符合下列4項：（1）引起DIC的基

21、礎(chǔ)疾?。翰∫蛟\斷（2）有DIC的臨床表現(xiàn)：臨床診斷（3）DIC的實驗室檢查：實驗診斷（4）對肝素治療有效：治療診斷,臨床應(yīng)用1、國外DIC的記分診斷標準（表9）,2、國外DIC的記分診斷標準（表10）,3、日本厚生省DIC診斷記分標準 表11,注：計分＞7分確診DIC，計分6可疑DIC，＜5則可能性少，可疑時補做：Sfmc、DD、TAT、PAP，動態(tài)plt，抗凝治療有效,4、國內(nèi)基層單位DIC診斷標準（1999）對臨床懷疑，

22、有下列7項中3項即可診斷DIC（1）PLT＜50×109/L或進行性↓（2）Fg ＜1.5g/L或≥4.0g/L，且呈進行性變 化（3）3P試驗（+）或FDP ≥20mg/L（4）PT縮短/延長＞3s，或呈動態(tài)變化（5）外周血涂片破碎紅細胞＞10%（6）ESR ＜15mm/h（7）血凝塊在2h內(nèi)出現(xiàn)溶解現(xiàn)象,方法學評價1、DIC常用實驗指標的評價（表7）,2、DIC聯(lián)合實驗指標分析（表8）,方法學評價

23、 見表7、表8。我院對864例DIC患者進行統(tǒng)計，它們的敏感性、特異性和診斷準確率分別為60%、66%和63%；對DIC前期109例患者的敏感性、特異性和診斷準確率分別為80%、68%和74%。Wada等（2003）DIC的診斷標準作了前瞻性評價，結(jié)果顯示：敏感性為91%，特異性為97%。由此可見，所用DIC實驗診斷指標，基本上可以滿足臨床需求。,（六）自動化儀器在血栓 與止血篩選試驗中的應(yīng)用,1、血

24、栓彈力圖（thrombelastograph，TEG） 承載全血標本的測試杯以4º45’左右擺動，當杯中凝血啟動，置于杯中的金屬針受到凝血塊生成/溶解的切應(yīng)力作用，隨之一起擺動。金屬針在擺動過程中所產(chǎn)生的電流，經(jīng)電腦軟件處理后，便形成曲線。這種儀器稱血栓彈力儀，所形成的曲線稱血栓彈力圖（TEG）,圖6 TEG各參數(shù)的形成,表 12 TEG主要參數(shù)及其含量,臨床應(yīng)用,（1）判斷凝血狀態(tài)：低凝、高凝狀態(tài) 低凝狀態(tài)：R、K值

25、都延長 高凝狀態(tài)：R、K值都縮短 指導血漿制品的選擇（2）判斷肝素/LMWH療效：有效、過量、抵抗 普通檢測R、K值=肝素R、K值，示無肝素存在 普通檢測R、K值＞肝素R、K值，示有肝素存在 指導肝素/LMWH使用和魚精蛋白中和,（3）判斷抗血小板治療：有效、過量、抵抗 用TEG的血小板定位圖（platelet mapping）。 使用抗血小板藥后血小板抑制率＜20%為抵抗。 使用抗血小板藥后血小板抑制

26、率50%～75%為有效。（4）評估非心臟手術(shù)后血栓事件的發(fā)生率 應(yīng)該維持MA值＜67mm將大大降低血栓事件 若MA值＞ 67 ～72mm，血栓發(fā)生率為16%。 若MA值＞ 72 ～95mm，血栓發(fā)生率為32%。,（5）評估PCI后血栓事件的發(fā)生機率 若PCI后，MA值＞65～68mm，發(fā)生率為10%。 若PCI后，MA值＞68～72mm，發(fā)生率為14%。 若PCI后，MA值＞72mm，發(fā)生率為60%。（6）其

27、他應(yīng)用 區(qū)別原發(fā)性纖溶和繼發(fā)性纖溶（DIC） 判斷高凝狀態(tài)原因：凝血亢進、血小板活性↑ 鑒別手術(shù)出血：外科出血、內(nèi)科出血,2.血小板功能分析儀（platelet function analyzer-100,PFA-100) 體外篩選血小板黏附和聚集的儀器。以標有膠原/腺上腺素（CEPI）和膠原/ADP（CADP）兩種纖維膜為誘導劑，以觀察膜孔閉合時間（closure time，CT）為結(jié)果。參考范圍 CEPI為61～20

28、3s；CADP：48 ～187s,,,,,,,,,,,In Vivo Haemostasis,PFA100.avi,,,capillary 200µm,aperture150µm,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,epinephrine or ADP,platelet,vWF,erythrocyte,,,,,,FLOW,,,- 40 mbar,,,collagen,membrane,,,,,,,,

29、PFA-100® Test Principle,lumen,fibrinogen,platelet,collagen fibrils,erythrocyte,endothelial cell,vWF,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,臨床應(yīng)用 一期止血缺陷的篩選試驗。敏感性：CEPI/CADP為82.5%/66.9%特異性：

30、 CEPI/CADP為88.7%/85.5%陰性預測值： CEPI/CADP為83%/75%陽性預測值： CEPI/CADP為88%/79%,vWD：CEPI/CADP的敏感性為88%/87%；特異性為95%/95%。血小板無力癥：CT延長，可替代BT，準確、可靠。服用ASA時：CEPI的CT延長，CADP可正常；與其他疾病與藥物誘導血小板功能異常鑒別的敏感性和特異性分別為100%和50%。,方法學評價 PF

31、A-100操作簡便、快速、結(jié)果準確。CEPI/CADP的變異系數(shù)為12%/8%，與PAgT有良好相關(guān)性。 受PLT↓、貧血（Hct＜30%）、O型血型、3.8%枸櫞酸鹽和富含核黃素食物等的影響；Fg的裂解肽可影響 Fg-vWF/GPⅡb-Ⅲa的結(jié)合,圖 實驗室檢測的全面質(zhì)量管理注：分析測定包括：工作環(huán)境、人員素質(zhì)、室間質(zhì)評、室內(nèi)質(zhì)控、儀器設(shè)備、操作標準、試劑準備、方法選擇。,,,分析中質(zhì)量保證,謝謝，請指導。