鮮食蔬菜中食源性致病菌的MALDi-TOF MS鑒定.pdf

1、鮮食蔬菜的食源性致病菌污染已成為全球普遍關(guān)注的熱點問題。為了有效監(jiān)控食源性致病菌污染、降低其對人類健康的危害、保障我國農(nóng)產(chǎn)品消費安全，有必要進行快速、可靠的檢測鑒定技術(shù)的研究。然而，現(xiàn)有的食源性致病菌檢測鑒定方法存在處理步驟復(fù)雜、工作量大、檢測鑒定周期長等諸多缺點，不能完全滿足簡單、快速、高通量的檢測要求。目前，基于基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)的分析方法為食源性致病菌的檢測鑒定提供了新思路。但是在鮮食

2、蔬菜中，此技術(shù)的應(yīng)用尚處于起步階段。因此本文針對其關(guān)鍵前處理技術(shù)及質(zhì)譜影響因素進行了初步探索，詣在建立一種適合鮮食蔬菜中食源性致病菌檢測鑒定的快速、可靠、高通量方法，且利用所建立的方法對鮮食蔬菜中的病原菌污染狀況進行了初步分析。本實驗主要研究結(jié)果如下:
　　1.以大腸桿菌、大腸桿菌O157∶H7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌的標準菌株為模式菌，考察了基質(zhì)溶液配比，菌株培養(yǎng)條件，溶劑處理方法，點樣方法及比例等條件對

3、質(zhì)譜鑒定結(jié)果的影響，最終確定了用BHI培養(yǎng)基24h培養(yǎng)菌株，以70％甲酸和等量乙腈提取細菌蛋白，樣品溶液和基質(zhì)溶液以覆蓋法1μL+1μL點樣分析，基質(zhì)溶液選擇體積比為19∶20∶1的水、乙腈、三氟乙酸三者混合溶液的α-氰-4-羥基肉桂酸(CHCA)飽和溶液作為所有菌株的前處理方法。不同濃度菌液經(jīng)處理后的鑒定結(jié)果顯示，本方法檢測限為106～109 cfu/mL;穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示，相同菌株的鑒定結(jié)果一致，平均得分均大于95％，變異系數(shù)均小

4、于5％。表明該方法滿足一般增菌培養(yǎng)之后的病原菌檢測需求，且穩(wěn)定性和重復(fù)性均較好。
　　2、分別用所建立的MALDI-TOF MS方法和16S rRNA基因測序法對7株標準菌株和93株分離株進行了分析，以此驗證MALDI-TOF MS的可靠性。結(jié)果表明MALDI-TOF MS在94％屬水平、83％種水平上與16S rRNA基因測序鑒定結(jié)果一致。對于其中的56株食源性致病菌分離株，MALDI-TOF MS可做到100％屬水平、96.4