幾種食源性致病菌快速檢測(cè)技術(shù)的建立.pdf

1、近年來，由于食品安全事件頻發(fā)，食品安全問題越來越成為社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)。其中，食源性致病菌是引起食品安全問題的重要因素。金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、蠟樣芽胞桿菌和溶藻弧菌是常見的食源性致病菌。目前檢測(cè)食源性致病菌手段主要采用細(xì)菌分離、培養(yǎng)、生化鑒定等方法，操作繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，每次只能檢出一種細(xì)菌，一般需要5～7天才能給出檢測(cè)報(bào)告，且敏感度低、特異性差。因此研究食源性致病菌快速、準(zhǔn)確檢測(cè)方法以預(yù)防和

2、控制食品安全事件的發(fā)生，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 近年來，隨著食源性致病菌的全基因序列的測(cè)定與分析，以及大量毒株部分基因序列的獲得，越來越多的分子生物學(xué)技術(shù)以其快速、靈敏等優(yōu)勢(shì)得到了廣泛的應(yīng)用。本文根據(jù)以上提到的幾種常見的食源性致病菌的保守毒力基因序列，分別建立了副溶血弧菌tdh基因的LAMP檢測(cè)方法，五種食源性致病菌多重PCR檢測(cè)方法，七種食源性致病菌基因芯片檢測(cè)方法，為食源性疾病的快速診斷和預(yù)警監(jiān)測(cè)體系的建立提供了重要的技

3、術(shù)保障。
　　 環(huán)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)是一種在等溫條件下高特異性、高效、快速地?cái)U(kuò)增靶基因的DNA擴(kuò)增技術(shù)。應(yīng)用在線軟件Primer ExplorerV4.0，針對(duì)副溶血弧菌特異性的毒力基因tdh基因設(shè)計(jì)LAMP引物。對(duì)反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)將建立的LAMP檢測(cè)方法與PCR方法進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明，LAMP檢測(cè)最適反應(yīng)在60.8℃恒溫條件45min內(nèi)完成，凝膠電泳呈現(xiàn)梯形條帶，與其他常見的細(xì)菌無交叉反應(yīng)。LAMP

4、檢測(cè)方法的細(xì)菌DNA最低檢出限為35.5fg/反應(yīng)管，靈敏度較PCR高10倍，而且LAMP方法在1 h內(nèi)完成檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，不需復(fù)雜儀器，用建立的LAMP方法對(duì)扇貝樣品中分離菌株進(jìn)行了檢測(cè)表明，LAMP方法對(duì)檢測(cè)致病性副溶血弧菌具有很好的可靠性。
　　 多重PCR是在一個(gè)反應(yīng)體系中加入了多對(duì)引物，在同一體系中對(duì)多個(gè)目的片段同時(shí)擴(kuò)增。該方法克服了常規(guī)PCR及LAMP檢測(cè)一次只能擴(kuò)增一個(gè)目的片段的缺點(diǎn)。本文探索了一種同時(shí)特異性地檢測(cè)

5、五種常見食源性致病菌的多重PCR方法。根據(jù)目前食品中常見病原菌副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、單核細(xì)胞增生性李斯特菌 Listeriamonocytogenes、腸炎沙門氏菌 Salmonella enteritidi、福氏志賀氏菌 ShigellaFlexneri的相關(guān)毒力基因，選擇具有特異性的副溶血弧菌不耐熱溶血毒素基因(thermolabile h

6、emolysin gene，tlh)、金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因(heat stablenuelease gene，nuc)、單核細(xì)胞增生性李斯特菌的編碼溶血素O基因hlyA、腸炎沙門氏菌的侵襲蛋白A基因(invasion protein A gene，invA)及志賀氏菌侵襲性質(zhì)?？乖璈基因(invasion plasmid antigen H gene，ipaH)，分別設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化并評(píng)

7、價(jià)了其特異性和靈敏度。通過對(duì)扇貝樣品檢測(cè)驗(yàn)證了此多重PCR體系具有很好的可靠性和實(shí)用性。
　　 本文建立了基于多重PCR結(jié)合基因芯片技術(shù)同時(shí)檢測(cè)副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、沙門氏菌、志賀氏菌、蠟樣芽胞桿菌和溶藻弧菌的方法。選擇副溶血弧菌不耐熱溶血毒素基因、金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因、單核細(xì)胞增生性李斯特菌編碼溶血素O基因、沙門氏菌侵襲蛋白A基因及志賀氏菌侵襲性質(zhì)粒抗原H基因進(jìn)行五重PCR擴(kuò)增，選擇蠟樣

8、芽胞桿菌非溶血毒素基因(non-haemolytic enterotoxin operon，nheA)和溶藻弧菌類似Rposs因子(Rpos-like sigma factor，rpoX)基因進(jìn)行兩重PCR，兩組多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)與芯片上的特異性探針雜交，檢測(cè)7種食源性致病菌。采用該方法對(duì)15種細(xì)菌分別進(jìn)行芯片檢測(cè)，僅7種目標(biāo)菌得到陽(yáng)性擴(kuò)增，顯示陽(yáng)性信號(hào)，說明該方法特異性高。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，基因芯片檢測(cè)致病菌的靈敏度較常規(guī)PCR高10