快速檢測腸道致病菌的PCR技術(shù)的研究.pdf

1、食品安全是一個越來越引起人們重視的問題，不僅影響到人們的生活、工作和健康，更是關(guān)系到國計民生的大事。在各種食物中毒中，細(xì)菌性食物中毒是食物中毒的主要因素。食品中的腸道致病菌是引起人類食源性疾病的主要原因之一，而傳統(tǒng)的病原微生物檢測耗時長，操作煩瑣，對有些細(xì)菌也不能給出理想的鑒定結(jié)果，在實際運用中遇到越來越多的問題。鑒于此，我們對當(dāng)前最先進(jìn)、最敏感的PCR檢測技術(shù)進(jìn)行研究，在于建立快速簡便、定量準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強、經(jīng)濟(jì)實用的檢測方法

2、。本文針對在我國食物中毒中最常見的腸科桿菌進(jìn)行研究，尋找食物中毒診斷及醫(yī)療衛(wèi)生檢驗的有效途徑。本文涉及的腸科桿菌有產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌、侵襲性大腸埃希菌、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬等。 多重PCR是在同一PCR反應(yīng)體系中加入二對以上的引物，同時擴(kuò)增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)。多重PCR具有高效性，系統(tǒng)性，經(jīng)濟(jì)簡便性等特點。首先篩選出種或?qū)匍g特異性基因序列，按照引物設(shè)計原則設(shè)計引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過調(diào)整MgCl<,2>濃度、引物濃度

3、、Taq酶用量、模板濃度、退火溫度和循環(huán)數(shù)參數(shù)等，優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系。這些目的基因的引物在一個混合的PCR體系中擴(kuò)增出各自的基因片段，并且特異性、靈敏度都和單獨PCR擴(kuò)增近似，幾種菌隨機組合的擴(kuò)增也很成功，未出現(xiàn)相互間強抑制現(xiàn)象。所用時間也與單獨PCR相同，從處理樣品開始僅需要2～3h就可得到結(jié)果。同時我們對樣品的檢測與食品衛(wèi)生微生物檢驗標(biāo)準(zhǔn)的符合率達(dá)100％。組裝的試劑盒穩(wěn)定性和重復(fù)性很好，因此該試劑盒有一定的應(yīng)用價值，可在生產(chǎn)實

4、踐中推廣應(yīng)用。實時熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性好、無需PCR反應(yīng)后處理步驟等優(yōu)點，近年來廣泛應(yīng)用于食品和臨床檢驗方面。本研究針對編碼產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌的耐熱腸毒素ST Ⅰ和不耐熱腸毒素LT Ⅰ的基因片段設(shè)計引物、探針，分別使用的是MGB-Taqman探針和普通的Taqman探針。制備陽性標(biāo)準(zhǔn)品，探索實時熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，檢測PCR反應(yīng)液中的熒光強度，得到熒光定量PCR的反應(yīng)曲線。由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線