市售涼拌菜致病菌污染分析及PCR快速檢測方法建立.pdf

1、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、蠟樣芽胞桿菌和大腸桿菌O157是五種極易污染食品的微生物，從而導(dǎo)致食源性疾病爆發(fā)，引起食品安全問題。因此，這五種食源性微生物對(duì)人類的健康、生活造成極大的損失和危害。涼拌菜是一種深受消費(fèi)者青睞的即食菜肴，它制作簡易、價(jià)格便宜、食用方便，已經(jīng)成為消費(fèi)者餐桌上的常見菜品。然而，目前我國尚未出臺(tái)有關(guān)涼拌菜加工制作的衛(wèi)生規(guī)范，由于涼拌菜儲(chǔ)存和銷售的衛(wèi)生情況良莠不齊，而且消費(fèi)者購買之后可不經(jīng)加熱直接

2、食用，因此，涼拌菜極易被各種食源性致病菌污染。
　　目前，食品安全檢測部門仍采用傳統(tǒng)的分離鑒定方法來檢測致病菌，該方法雖然準(zhǔn)確但步驟繁瑣且耗時(shí)長，在實(shí)際爆發(fā)疫情時(shí)，不能滿足檢測的需要。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的檢測方法憑借其高效快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢，在突發(fā)的食品安全事故中，更能滿足快速檢測病原菌的需要。本文旨在了解市售涼拌菜致病菌污染狀況，利用一些新型高特異性靶點(diǎn)建立高效靈敏的PCR快速檢測方法，為食源性致病菌安全控制提

3、供依據(jù)。取得的主要結(jié)果如下:
　　1、市售涼拌萊致病菌污染狀況調(diào)查從超市、農(nóng)貿(mào)市場、流動(dòng)攤販采集市售涼拌菜共計(jì)99份，按照國標(biāo)法進(jìn)行沙門氏菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157、蠟樣芽孢桿菌檢測，同時(shí)利用PCR方法同步進(jìn)行初篩。調(diào)查表明，在采集的99份涼拌菜樣品中，金黃色葡萄球菌污染較嚴(yán)重，污染率為8.08％，其次是單增李斯特氏菌(6.06％)、沙門氏菌(2.02％)，未檢測到蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌O157污染。三類

4、涼拌菜中，肉制品類涼拌菜的致病菌污染率高于蔬菜類、豆制品類。流動(dòng)攤販的致病菌污染率顯著高于農(nóng)貿(mào)市場、超市。PCR法由于假陽性，初篩檢出率高于國標(biāo)法。
　　2、市售涼拌菜致病菌多重PCR檢測方法的建立根據(jù)生物信息學(xué)方法挖掘得到的新靶點(diǎn)設(shè)計(jì)三對(duì)引物:沙門氏菌SC8、單增李斯特氏菌lm16、金黃色葡萄球菌Sa5，用于多重PCR檢測。在單重PCR反應(yīng)中，針對(duì)39株沙門氏菌、17株金黃色葡萄球菌、10株單增李斯特氏菌和20株其余陰性對(duì)照菌，

5、對(duì)三對(duì)引物進(jìn)行單重PCR特異性驗(yàn)證，三對(duì)引物均表現(xiàn)出了較高的特異性。三對(duì)引物在單重PCR反應(yīng)中表現(xiàn)出了較高的靈敏度:SC8為340.3 fg/μL，lm16為10.40 fg/μL，Sa5為173.7 fg/μL。對(duì)多重PCR體系中的Mg2+、dNTP Mixture、TaqDNA聚合酶、退火溫度、循環(huán)次數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化研究，經(jīng)過優(yōu)化之后的25μL多重PCR反應(yīng)體系為:2.5μL10×PCR Buffer、4.0μL MgCl2(25mM)

6、、2μL dNTP Mixture(各2.5mM)、0.5μL Taq酶(5.0U)、6.0μLDNA模板(三種致病菌各2.0μL)，引物(10 umol) lm16、SC8、Sa5分別為0.5μL、1μL、2.6μL，ddH2O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?①94℃2 min;②94℃30s;③60℃30s;④72℃90 s;⑤72℃10 min;②～④步重復(fù)30次。多重PCR體系具有較好的特異性，在沙門氏菌、單增李斯特氏菌、金黃

7、色葡萄球菌隨機(jī)組合成的26個(gè)DNA組合中擴(kuò)增出了三條對(duì)應(yīng)的條帶。多重PCR細(xì)菌純培養(yǎng)物的靈敏度為103cfu/mL。
　　3、多重PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定性評(píng)價(jià)及檢測應(yīng)用在無反復(fù)凍融情況下，置于4℃下保存，在40天內(nèi)多重PCR檢測效果較好;置于-20℃、-70℃下保存，在60天內(nèi)多重PCR檢測效果較好。在反復(fù)凍融情況下，置于-20℃和-70℃下保存30天的PCR反應(yīng)體系，受反復(fù)凍融的影響要稍小于4℃保存。置于4℃下保存30天的PCR反應(yīng)

8、體系在凍融10次內(nèi)擴(kuò)增時(shí)，檢測效果穩(wěn)定。置于-20℃和-70℃下保存30天的PCR反應(yīng)體系在凍融12次內(nèi)擴(kuò)增時(shí)，檢測效果穩(wěn)定。隨著凍融次數(shù)的增加，PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增效果越來越差;同一批次重復(fù)性試驗(yàn)和不同批次重復(fù)性試驗(yàn)表明，相同時(shí)間或不同時(shí)間組裝的PCR反應(yīng)體系，只要在無菌操作臺(tái)中規(guī)范操作，均可保證其結(jié)果的重復(fù)性、可靠性;采集50份樣品，用于評(píng)價(jià)多重PCR檢測體系。多重PCR用于實(shí)際樣品檢測，檢出5株單增李斯特氏菌，2株沙門氏菌，6株金