豬場(chǎng)環(huán)境中主要致病菌污染多重PCR監(jiān)測(cè)方法的建立.pdf

1、大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌、豬葡萄球菌是豬場(chǎng)中主要的致病細(xì)菌，致病性與其毒力基因密切相關(guān)。本研究分別以每種細(xì)菌特異性毒力基因的高度保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，建立監(jiān)測(cè)豬場(chǎng)主要病原菌污染的多重PCR方法。
　　選擇參考毒株大腸桿菌的LTa、STa、STb基因，鏈球菌2型的CPS2J基因，沙門氏菌的spvR基因，多殺性巴氏桿菌的kmt基因，胸膜肺炎放線桿菌的ApxIVA基因，分離鑒定的豬葡萄球菌nuc基因?yàn)槟康幕蛟O(shè)計(jì)

2、引物。對(duì)每一對(duì)引物的濃度、退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。以大腸桿菌三個(gè)基因引物濃度分別為0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.4μmol/L，鏈球菌2型引物為0.1μmol/L，豬葡萄球菌引物為0.2μmol/L，退火溫度為49.4℃，建立了五重PCR方法，重復(fù)性好，最低檢出量依次為：10-5 ng/μL、10-3ng/μL、10-1 ng/μL、10-3ng/μL、10-3ng/μL。以沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌的引物濃度分

3、別為0.4μmol/L、0.2μmol/L、0.8μmol/L，退火溫度為50.6℃，建立了三重PCR方法，重復(fù)性好，最低檢出量依次為：10-3ng/μL、10-6ng/μL、10-2ng/μL。用建立的兩種多重PCR方法分別對(duì)大腸桿菌參考毒株CVCC196、CVCC209、CVCC1519、CVCC1495，沙門氏菌參考菌株CVCC503、CVCC541，多殺性巴氏桿菌參考菌株CVCC1746，副豬嗜血桿菌參考菌株CVCC3728，鏈

4、球菌2型參考菌株CVCC606，胸膜肺炎放線桿菌參考菌株CVCC268和分離毒株豬葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、鏈球菌各一株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明兩種多重PCR方法均具有良好的特異性。
　　人工模擬污染環(huán)境中細(xì)菌監(jiān)測(cè)，選用大腸桿菌，采用壓縮式霧化器進(jìn)行霧化，細(xì)菌濃度108 CFU/m3。用氣體采樣泵收集空氣，流量6L/min，收集液為20 mL pH7.4 PBS緩沖液，收集時(shí)間30min。超濾法濃縮細(xì)菌，細(xì)菌基因組DNA提取試

5、劑盒提取DNA。應(yīng)用構(gòu)建的多重 PCR方法對(duì)其樣品進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示大腸桿菌的最低檢出量為6CFU/mL，表明建立的多重PCR方法可用于空氣樣品的監(jiān)測(cè)。
　　應(yīng)用建立的兩種多重PCR方法對(duì)采自延津、濟(jì)源、駐馬店、三門峽4個(gè)豬場(chǎng)環(huán)境中的44份空氣樣品及濟(jì)源某豬場(chǎng)12份糞便樣品進(jìn)行監(jiān)測(cè)，空氣樣品中濟(jì)源檢出LTa、STa陽(yáng)性各6份，各占13.6％；spvR陽(yáng)性4份，占0.90％；駐馬店檢出CPS2J陽(yáng)性10份，占22.7％；三門峽檢出k