南美白對蝦中常見食源性致病菌快速檢測技術(shù)及分子預(yù)測微生物模型的構(gòu)建.pdf

1、南美白對蝦是中國和亞洲其他地區(qū)最為重要的水產(chǎn)品之一，同時，因為其味道鮮美、營養(yǎng)豐富，也是這些區(qū)域最受歡迎的食品之一。副溶血性弧菌、單增李斯特菌和沙門氏菌是水產(chǎn)品中最為常見的三種食源性致病菌，已經(jīng)成為水產(chǎn)品中的重要威脅。微生物風(fēng)險評估被視為解決這些潛在威脅的有效途徑，同時高通量檢測技術(shù)和高效的預(yù)測微生物學(xué)模型能夠為微生物風(fēng)險評估提供強有力的技術(shù)支持。因此，本文旨在探究（1）構(gòu)建一種高通量檢測技術(shù)用于生鮮南美白對蝦中副溶血性弧菌、單增李斯特

2、菌和沙門氏菌的快速檢測；（2）構(gòu)建一種活菌定量技術(shù)用于同時定量檢測生鮮南美白對蝦中活的副溶血性弧菌和單增李斯特菌；（3）構(gòu)建一個有效的分子預(yù)測微生物學(xué)模型用于描述采收后生鮮南美白對蝦中自然存在的副溶血性弧菌的行為變化。本研究主要研究內(nèi)容和研究結(jié)果如下：
　　1.生鮮南美白對蝦中副溶血性弧菌、單增李斯特菌及沙門氏菌快速檢測方法的構(gòu)建
　　本研究構(gòu)建了一種多重?zé)晒舛縋CR方法，用以同時檢測生蝦中常見的三種食源性致病菌：副溶血性

3、弧菌，單增李斯特菌以及沙門氏菌。通過26株受試菌株的驗證試驗，證明這種方法具有極高的特異性。運用兩種標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建方法評價該方法的擴增效率，結(jié)果表明無論在純培養(yǎng)還是人工接種的蝦樣中，該方法都具有卓越的擴增效率。同時，在人工接種的蝦樣中，測得該多重實時熒光PCR方法的檢測限低達102 CFU/g。最后，通過48個實際樣品的檢測結(jié)果進行驗證，該方法與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法的結(jié)果保持一致，而且相較于費時費力的傳統(tǒng)方法，該方法在提取DNA后只需要50分鐘就

4、能直接獲得生蝦中三種食源性致病菌的檢測結(jié)果。因此，這項快速高效的PCR技術(shù)可用于檢測水產(chǎn)品中的三種食源性致病菌，從而維護水產(chǎn)品的質(zhì)量和保障公眾的身體健康。
　　2.生鮮南美白對蝦中副溶血性弧菌及單增李斯特菌活菌定量方法的構(gòu)建
　　本研究首次構(gòu)建了一種疊氮溴化丙錠（PMA）結(jié)合多重實時熒光PCR活菌定量的方法，可用于同時定量檢測生鮮南美白對蝦中活的副溶血性弧菌和單增李斯特菌。通過PMA濃度優(yōu)化實驗，確定了100μM的PMA使用

5、濃度，可與多重實時熒光PCR技術(shù)相結(jié)合，從而抑制108 CFU/mL副溶血性弧菌和單增李斯特菌死菌DNA的擴增。通過96株受試菌株的驗證試驗，證明這種方法具有極高的特異性。并運用人工接種蝦樣構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定了該方法對于副溶血性弧菌和單增李斯特菌具有極佳的擴增效率，分別為100％和106%。此外，該方法被成功地應(yīng)用于4℃條件下生蝦樣品中副溶血性弧菌和單增李斯特菌行為變化的描述。而且，對比于傳統(tǒng)的平板計數(shù)方法，本方法從采樣到最終結(jié)果的輸

6、出僅需要5個小時。因此，這種全新的多重活菌定量技術(shù)可提供一種有效的工具用于水產(chǎn)品中常見食源性致病菌的監(jiān)控與分析和預(yù)測微生物學(xué)模型的構(gòu)建，并為定量微生物風(fēng)險評估提供可靠的數(shù)據(jù)，從而達到保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全和改善公共衛(wèi)生狀況的目的。
　　3.采收后生鮮南美白對蝦中自然存在的副溶血性弧菌分子預(yù)測微生物模型的建立與驗證。
　　本研究建立了采收后南美白對蝦中自然存在的副溶血性弧菌在不同溫度下（4、7、15、20、25、30 oC）的分子

7、預(yù)測微生物學(xué)模型。選擇PMA實時熒光PCR技術(shù)作為定量方法，運用Baranyi模型進行副溶血性弧菌一級模型的擬合，平方根模型和非線性阿倫尼烏斯方程進行副溶血性弧菌二級模型的擬合，并通過同一區(qū)域生蝦樣品中的副溶血性弧菌在18、23、28℃下的生長數(shù)據(jù)進行模型的驗證。結(jié)果顯示：自然存在的副溶血性弧菌在4、7 oC條件下緩慢失活，失活速率分別為-0.019 Log CFU/g/h和-0.025 Log CFU/g/h，而在15、20、25、3

8、0 oC條件下，自然存在的副溶血性弧菌處于生長狀態(tài)，生長速率分別為0.044 Log CFU/g/h、0.105 Log CFU/g/h、0.179 Log CFU/g/h和0.336 Log CFU/g/h，延滯期分別為15.451 h、7.259 h、4.427 h和3.741h。平方根模型與非線性阿倫尼烏斯模型的驗證指標(biāo)A f值與B f值均處于0.9-1.1之間，說明該模型對采收后南美白對蝦中自然存在的副溶血性弧菌的生長行為具有良