FTA濾膜用于基因芯片檢測(cè)肉中常見食源性致病菌的研究.pdf

1、通過不對(duì)稱PCR技術(shù)和基因芯片技術(shù)建立了一種準(zhǔn)確、快速和高敏感性的檢測(cè)肉中常見食源性致病菌的方法。用FTA濾膜從食品樣品中直接提取模板DNA。用玻片作基因芯片的固相載體。選擇常見的引起食物中毒的15株菌的16SrDNA基因的一個(gè)片段作為目的基因。設(shè)計(jì)這段基因的一對(duì)通用引物，下游引物用Cy5標(biāo)記。對(duì)兩輪不對(duì)稱PCR反應(yīng)體系中退火溫度、Mg2+濃度進(jìn)行了優(yōu)化，以確定適宜PCR反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增程序。第一輪適宜反應(yīng)體系分別為:5uL的10×

2、PCR buffer，0.5uL的20mmol/L，dNTP，引物F1、R2各luL(25umol/L)，0.5uL的Taq酶(2.5U)，含有基因組DNA模板的濾膜，用去離子水補(bǔ)足到50 uL。循環(huán)的條件為:94℃變性5min，從94℃變性30s、58.8℃退火1 min到72℃延伸30s共25個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。第二輪適宜反應(yīng)體系為:5uL的10×PCR buffer，0.5uL的20 mmol/L dNTP，引物R2

3、 luL(25umol/L)，0.5uL的Taq酶(25U)，第一輪的PCR產(chǎn)物1.5uL，用去離子水補(bǔ)足到50uL。循環(huán)的條件為:94℃變性5 min，從94℃變性30s、55.6℃退火30s到72℃延伸30s共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。設(shè)計(jì)二十五條種屬的特異性探針，將它們氨基化修飾并點(diǎn)到玻片上，將不對(duì)稱PCR的15種擴(kuò)增產(chǎn)物與制作好的基因芯片雜交，用genepix4對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行分析。 結(jié)果表明10株食源性致病菌(

4、金黃色葡萄球菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌、霍亂弧菌、普通變形桿菌、擬態(tài)弧菌、單核增生李斯特菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、臘樣芽孢桿菌)的檢測(cè)具有高敏感性和特異性；副溶血性弧菌的敏感性相對(duì)較低；河流弧菌同副溶血性弧菌存在很弱的錯(cuò)雜交，乙型溶血性鏈球菌的檢測(cè)同單核增生李斯特菌和臘樣芽孢桿菌存在很弱的錯(cuò)雜交，但是均不影響檢測(cè)結(jié)果。大腸桿菌O157:H7和沙門氏菌由于同源性非常高，可以通過多重PCR方法檢測(cè)出來。整個(gè)樣品的檢測(cè)

5、過程耗時(shí)6h。本方法檢測(cè)靈敏度是102CFU/mL。 針對(duì)在線BLAST的不足，建立了16SrDNA基因核苷酸序列本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行寡核苷酸探針的本地BLAST以確保其特異性。通過與在線BLAST比較，本地BLAST在準(zhǔn)確性、冗余信息的去除以及使用簡(jiǎn)便性等方面要優(yōu)于在線BLAST。 基因芯片相比較其它檢測(cè)方法有很大的優(yōu)勢(shì)，它不僅準(zhǔn)確、快速、高效，而且高通量，可廣泛應(yīng)用于食源性致病菌感染的診斷、應(yīng)對(duì)和控制。