真菌性角膜病常見(jiàn)致病菌種檢測(cè)基因芯片的研究.pdf

1、鄭州大學(xué)博士學(xué)位論文真菌性角膜病常見(jiàn)致病菌種檢測(cè)基因芯片的研究姓名：張英朗申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：眼科學(xué)指導(dǎo)教師：王麗婭20070518鄭州大學(xué)博士學(xué)位論文真菌性角膜病常見(jiàn)致病菌種檢測(cè)基因芯片的研究桿菌、大腸桿菌、肺炎雙球菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳未發(fā)現(xiàn)有擴(kuò)增條帶，證實(shí)該P(yáng)CR體系具有較高的特異性。倍比稀釋法檢測(cè)PCR的靈敏度。當(dāng)DNA質(zhì)量濃度為10fg時(shí)，12種真菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物均有陽(yáng)性電泳條帶產(chǎn)生，PCR擴(kuò)增體系的整體靈敏度為

2、lOfg，提示該P(yáng)CR體系具有較高的敏感性。三、采用醛基化玻片制作基因芯片，對(duì)玻片處理方法進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)計(jì)并合成12條探針，分別針對(duì)腐皮鐮孢菌、串珠鐮孢菌、梨狀鐮孢菌、尖孢鐮孢菌、煙曲霉菌、黃曲霉菌、黑曲霉菌、土曲霉菌、牽連青霉菌、新月彎孢菌、鏈格孢霉菌、白色念珠菌，探針3’端氨基化修飾后，點(diǎn)樣于芯片上。選擇最優(yōu)化的雜交條件，分別用標(biāo)準(zhǔn)菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片進(jìn)行反向雜交。經(jīng)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)選定最適雜交溫度為42℃，雜交時(shí)間為lh，洗脫時(shí)間

3、為latin。12種真菌標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)CR產(chǎn)物與芯片雜交，均在各自相應(yīng)的區(qū)域顯示特異性的熒光信號(hào)。建立了一種熒光標(biāo)記的基因芯片檢測(cè)真菌性角膜病常見(jiàn)致病菌種的技術(shù)方法和優(yōu)化的雜交反應(yīng)體系。四、將腐皮鐮孢菌、煙曲霉菌、牽連青霉菌、新月彎孢菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別組合后與基因芯片雜交，并將人基因組DNA、單皰病毒I型和II型DNA、沙眼衣原體、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、肺炎雙球菌DNA，經(jīng)通用引物PCR擴(kuò)增后，將反應(yīng)混合物與

4、芯片雜交，對(duì)芯片的特異性進(jìn)行檢測(cè)。將腐皮鑲孢菌、煙曲霉菌、牽連青霉菌、新月彎孢菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別組合后與基因芯片雜交，均顯示各自典型的熒光信號(hào)，無(wú)交叉反應(yīng)發(fā)生。其他DNA擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片雜交無(wú)陽(yáng)性信號(hào)產(chǎn)生，顯示芯片具有較好的特異性。五、采用倍比稀釋法檢測(cè)芯片雜交體系的靈敏度。12種真菌標(biāo)準(zhǔn)菌株檢出的DNA質(zhì)量濃度量為lpg時(shí)所有菌株均有熒光信號(hào)顯示，O1pg時(shí)黑曲霉菌、土曲霉菌、牽連青霉菌和新月彎孢菌無(wú)熒光信號(hào)顯示，故芯