櫛孔扇貝(Chlamys farreri)幼蟲和成體組織細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系建立和特征分析.pdf

1、探索海洋貝類細(xì)胞培養(yǎng)體系建立方法的研究是一項(xiàng)意義重大且負(fù)有挑戰(zhàn)的課題。一方面體外細(xì)胞培養(yǎng)體系是闡明養(yǎng)殖病原微生物致病機(jī)制、細(xì)胞分子育種、功能基因的深入研究等諸多科研領(lǐng)域急需的實(shí)驗(yàn)工具；另一方面，目前在世界范圍內(nèi)，尚未建立針對海洋貝類生物細(xì)胞培養(yǎng)的成熟方法。本研究旨在建立一種適用于海洋貝類的細(xì)胞培養(yǎng)方法，提高貝類細(xì)胞培養(yǎng)體系的研究應(yīng)用能力。
　　本文以中國北方重要的經(jīng)濟(jì)貝類櫛孔扇貝為實(shí)驗(yàn)對象，選取多種細(xì)胞類型進(jìn)行體外培養(yǎng)體系建立的研

2、究。以優(yōu)化培養(yǎng)條件的傳統(tǒng)方法為基礎(chǔ)，通過添加因子和外源基因?qū)氲仁侄握T導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，建立了櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲和成體組織細(xì)胞體外培養(yǎng)體系；進(jìn)一步對櫛孔扇貝幼蟲體外傳代培養(yǎng)細(xì)胞的特性和功能進(jìn)行了初步分析。主要結(jié)果如下：
　　本文通過優(yōu)化細(xì)胞解離方法、向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)因子等，有效地促進(jìn)和維持了體外培養(yǎng)櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞的增殖能力和長期存活，成功地實(shí)現(xiàn)了幼蟲細(xì)胞在體外傳代培養(yǎng)19代。研究發(fā)現(xiàn)：使用無鈣海水配以機(jī)械法獲得的解離細(xì)胞活力明

3、顯高于使用膠原酶和胰酶酶解獲得的細(xì)胞；添加適宜濃度的胎牛血清可提高細(xì)胞的有絲分裂能力和貼壁能力；添加適宜濃度的櫛孔扇貝血清可提高體外培養(yǎng)細(xì)胞的貼壁能力和維持細(xì)胞形態(tài)；添加適宜濃度的卵黃提取液可促進(jìn)傳代培養(yǎng)后期細(xì)胞的增殖和貼壁能力； EGF和bFGF生長因子組合的添加可有效延長細(xì)胞壽命并維持細(xì)胞形態(tài)。擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞體外培養(yǎng)體系中主要包括3類細(xì)胞，分別是圓形透亮細(xì)胞、圓形顆粒大細(xì)胞和圓形黑色小細(xì)胞；其中圓形透亮細(xì)胞具有最佳的生理狀態(tài)，如在Pe

4、rco ll分離后體系中，該種類細(xì)胞于12 h后即可貼壁且分裂速度較快。但整體而言，3類細(xì)胞的增殖能力和貼壁能力均隨體外培養(yǎng)時(shí)間的延長呈現(xiàn)逐漸減弱的趨勢。進(jìn)一步，通過櫛孔扇貝ITS序列擴(kuò)增鑒定所獲體外傳代培養(yǎng)物屬于櫛孔扇貝細(xì)胞。
　　使用流式細(xì)胞儀檢測了櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲原代、第12代和第18代體系中S期細(xì)胞的比例，顯示隨著體外培養(yǎng)細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，S期細(xì)胞所占的比例逐漸降低；采用原位雜交技術(shù)比較了櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)原代細(xì)胞

5、和傳代細(xì)胞中piwi（參與維持細(xì)胞的自我更新特征）和phb2（細(xì)胞周期中抑制G1期向S期的過度）基因的表達(dá)，結(jié)果顯示：櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲原代和傳代培養(yǎng)體系中的3類細(xì)胞均可表達(dá)piwi和phb2基因；其中piwi基因在原代培養(yǎng)細(xì)胞胞質(zhì)中的陽性信號較第16代細(xì)胞的致密；phb2基因在第16代細(xì)胞中的表達(dá)明顯強(qiáng)于原代細(xì)胞；呈現(xiàn)出隨培養(yǎng)代數(shù)增多細(xì)胞的增殖能力逐漸衰退。
　　采用免疫組織化學(xué)技術(shù)揭示了體外培養(yǎng)細(xì)胞肌凝蛋白（細(xì)肌絲成分），5羥色

6、胺（神經(jīng)遞質(zhì)成分），肌動(dòng)蛋白和微管蛋白（細(xì)肌絲或細(xì)胞骨架成分）等的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)櫛孔扇貝幼蟲細(xì)胞體外培養(yǎng)至16代時(shí)，細(xì)胞中肌凝蛋白的表達(dá)較原代培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)期更加顯著，暗示該時(shí)期細(xì)胞有向肌細(xì)胞分化的趨勢，但其分化時(shí)間較正常發(fā)育的擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞晚。本次我們未在體外培養(yǎng)的幼蟲細(xì)胞中檢測到神經(jīng)遞質(zhì)5羥色胺的表達(dá)，與正常發(fā)育的中后期擔(dān)輪幼蟲頭部區(qū)細(xì)胞首先檢測到兩個(gè)表達(dá)位點(diǎn)的結(jié)果不一致。
　　本研究采用優(yōu)化培養(yǎng)體系的方法，建立了櫛孔扇貝血淋巴、鰓、卵

7、巢、精巢、心臟等成體組織細(xì)胞的原代培養(yǎng)體系，各種組織細(xì)胞均可在體外存活2.5周以上；進(jìn)一步，嘗試了脂質(zhì)體（Lipo2000）、陽離子聚合物（PEI）和慢病毒介導(dǎo)外源基因SV40LT（猿猴病毒大T抗原基因）誘導(dǎo)體外原代培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，其中慢病毒感染法對細(xì)胞傷害最小，轉(zhuǎn)染效率最高可達(dá)到25％，能夠使轉(zhuǎn)基因后的貝類體外培養(yǎng)細(xì)胞的平均存活壽命顯著延長，并在病毒感染后的心臟細(xì)胞培養(yǎng)體系中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂相。
　　綜上，本研究所建立的扇貝幼蟲體外