櫛孔扇貝(Chlamys farreri)EST-SNP的開發(fā)及其應(yīng)用.pdf

1、櫛孔扇貝(Chlamys fareri)是我國重要經(jīng)濟海水養(yǎng)殖貝類之一,近年來養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)了病害頻發(fā)、大規(guī)模死亡、個體小型化等問題,為此,進行品質(zhì)優(yōu)良、高產(chǎn)、生長迅速、抗病、抗逆新品種的選育成為其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)。分子標記輔助育種技術(shù)和基于分子標記的功能基因研究為優(yōu)良品種的培育提供了理論基礎(chǔ)和有效途徑。為此,本研究以櫛孔扇貝為主要研究材料,探討了櫛孔扇貝EST-SNP標記的有效篩選條件及其在櫛孔扇貝遺傳育種中的應(yīng)用。

2、>　　1.櫛孔扇貝EST-SNP分型技術(shù)的建立及標記的篩查和評價本研究針對HRM非標記探針技術(shù)進行改進,利用3'端非配對堿基進行探針的末端封閉,并對利用HRM非標記探針技術(shù)進行EST-SNP篩查的流程進行優(yōu)化,建立了一套高靈敏度、低成本篩查EST-SNP的技術(shù)體系。利用該技術(shù)體系,首次進行了大規(guī)模EST-SNP標記的開發(fā),從櫛孔扇貝5630個候選SNP位點中,成功篩選出1696個多態(tài)性SNP標記,并利用青島群體對其進行了評價,次要等位基

3、因頻率在0.010-0.500之間,觀測雜合度和期望雜合度分別介于0.000-0.942和0.020-0.507,所有的位點均處于連鎖平衡狀態(tài),102個位點偏離哈代-溫伯格平衡。這些位點將為櫛孔扇貝的遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、功能基因分析、QTL定位等奠定堅實的基礎(chǔ)。
　　同時以本研究結(jié)果為依據(jù),提出了進行EST-SNP篩選時,為提高多態(tài)性位點的篩選比例,應(yīng)優(yōu)先選擇含4條以上EST序列的contig大小、次要等位基因頻數(shù)在2以上并且次要等

4、位基因頻率高于25％的位點作為候選位點進行驗證實驗。
　　2.EST-SNP的種間通用性研究本研究進行了扇貝中EST-SNP的通用性研究,利用在櫛孔扇貝中篩選得到的34個多態(tài)性EST-SNP標記,在五個近源種扇貝(華貴櫛孔扇貝Chlamysnobilis、海灣扇貝Argopectens irradias、日月貝Amusium pleuronectes、蝦夷扇貝Patinopectenyessoensis、紫扇貝Argopecten

5、 purpuratus)中進行了通用性驗證。結(jié)果顯示有19個位點可以在至少一種近源扇貝中表現(xiàn)出多態(tài)性,其中2個位點在4種扇貝中保持多態(tài)性。研究結(jié)果表明,EST來源的SNP標記具有較好的通用性,并且統(tǒng)計顯示通用性較好的SNP位點多位同義突變,而非同義突變則在種間較難通用。
　　3.櫛孔扇貝任意BSA群體選擇性基因分型為了進行與表型相關(guān)基因的發(fā)掘,為分子標記輔助提供理論基礎(chǔ)和參考數(shù)據(jù),本研究在櫛孔扇貝兩個自然群體中選擇殼高極大和極小的

6、個體組成任意BSA群體,利用1696個EST-SNP標記,進行了選擇性基因分型,掃描與殼高相關(guān)的基因。研究發(fā)現(xiàn),有12個位點在殼高極大和殼高極小群體間存在基因頻率和(或)基因型頻率差異,其中6個位點存在基因頻率的差異,6個位點基因頻率差異不顯著但基因型頻率差異顯著。掃描結(jié)果對于進行櫛孔扇貝殼高決定基因的研究、以殼高性狀為目標的選種選育奠定了基礎(chǔ)。
　　4.櫛孔扇貝EST-SNP雄性遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建利用具有共父關(guān)系的三個全同胞家系

7、、一個父系半同胞家系和285個EST-SNP標記成功進行了櫛孔扇貝雄性遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建。所構(gòu)建的圖譜圖譜總長度為2025.4 cM,圖譜覆蓋度約為87.1％。標記間最大間隔為25.8cM,最小間隔為0.0cM,平均間隔為7.70cM;最長連鎖群234.5 cM,連鎖群最短22.3cM,平均長度為106.6cM;連鎖群上的分子標記數(shù)目最多為44個,最少為3個,每個連鎖群平均定位標記數(shù)目為15.0個。并初步進行了櫛孔扇貝主要生長性狀的QT