櫛孔扇貝(Chlamys farreri)單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用.pdf

1、單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是由單堿基顛換、轉(zhuǎn)換引起的DNA序列變異，而其中最少一種等位基因在群體中的頻率不小于1％。SNP以其位點(diǎn)豐富、有代表性、遺傳穩(wěn)定、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析等諸多優(yōu)點(diǎn)，成為繼限制性片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)和簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat，SSR)后的

2、第三代分子標(biāo)記，在遺傳學(xué)分析中得到廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)有的SNP開發(fā)技術(shù)有很多，本研究中主要采用高分辨率熔解曲線(HRM)和高通量測序技術(shù)開發(fā)基因區(qū)SNP標(biāo)記并且進(jìn)行群體多樣性和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建研究。
　　 1.櫛孔扇貝基因區(qū)SNP標(biāo)記的開發(fā)以及群體遺傳學(xué)研究
　　 本實(shí)驗(yàn)室已對櫛孔扇貝(Chlamys farreri)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行454高通量測序，得到轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，生物信息學(xué)分析得到大量的候選SNP位點(diǎn)，采用高分辨率熔解曲線非標(biāo)

3、記探針技術(shù)對候選SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測和分型，實(shí)現(xiàn)櫛孔扇貝SNP標(biāo)記的快速開發(fā)。本研究中首先設(shè)計(jì)了150組引物，其中103組引物成功擴(kuò)增。利用非標(biāo)記探針結(jié)合熔解曲線，共篩選SNP位點(diǎn)51個(gè)，并且對榮成群體48個(gè)個(gè)體進(jìn)行群體多樣性的初步研究；51個(gè)SNP位點(diǎn)中有49個(gè)呈現(xiàn)多態(tài)性，最小等位基因頻率在0.0610-0.5000之間，觀測雜合度和期望雜合度分別在0.0833-0.8889和0.0833-0.5833。除2個(gè)位點(diǎn)外其余都符合哈迪-溫伯

4、格平衡(P<0.05)，位點(diǎn)間沒有顯著的連鎖不平衡。結(jié)果表明高分辨率熔解曲線非標(biāo)記探針技術(shù)是檢測和分型SNP標(biāo)記的一種可行方法，這些SNP位點(diǎn)將有助于櫛孔扇貝的群體遺傳多樣性評估和分子標(biāo)記輔助育種工作。
　　 2.基于基因區(qū)SNP標(biāo)記的櫛孔扇貝遺傳連鎖圖譜構(gòu)建
　　 構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜對于基因QTL定位、確定經(jīng)濟(jì)性狀遺傳標(biāo)記、進(jìn)行分子輔助育種都具有重要意義。本研究以關(guān)聯(lián)家系的一個(gè)全同胞家系作為研究對象，在HRM分型的

5、SNP信息的基礎(chǔ)上，和用MultiSNP技術(shù)，結(jié)合SOLiD測序得到大量的SNP位點(diǎn)分型信息，從而構(gòu)建了櫛孔扇貝整合遺傳連鎖圖譜。共設(shè)計(jì)了引物1300組，將300或350組引物等量混合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過SOLiD測序，得對SNP不同基因型。構(gòu)建的櫛孔扇貝整合的圖譜中，362個(gè)標(biāo)記共被劃分為19個(gè)連鎖群，每個(gè)連鎖群的SNP標(biāo)記數(shù)目從8-33個(gè)不等，連鎖群標(biāo)記數(shù)最多的是2號(hào)連鎖群，共33個(gè)SNP標(biāo)記，連鎖群標(biāo)記數(shù)目最少的是19號(hào)連鎖群，共8個(gè)S

6、NP標(biāo)記數(shù)，平均每個(gè)連鎖群有19個(gè)標(biāo)記；圖譜標(biāo)記的平均間隔為5.0cM，其中10個(gè)連鎖群的平均間隔小于5.0cM，16號(hào)連鎖群的平均間隔最小，為3.5cM；連鎖群的大小范圍為42.8cM-142.1cM，整合圖譜長度為1825.1cM，利用第一種估算方式，整合后圖譜的預(yù)期長度為2015.1cM，利用第二種估算方式，整合后圖譜的預(yù)期長度為2035.7cM，兩種方式的平均值為2025.4cM，圖譜覆蓋率為90％。
　　 在櫛孔扇貝轉(zhuǎn)