奶牛BoLA-A表達(dá)檢測(cè)及其在主要組織細(xì)胞分布研究.pdf

1、奶牛不孕是制約畜牧業(yè)生產(chǎn)的主要問題;圍植入期著床不穩(wěn)定或失敗是造成動(dòng)物不孕的主要原因。著床失敗涉及妊娠識(shí)別、子宮容受態(tài)形成、合子基因突變、囊胚與子宮容受態(tài)形成的時(shí)機(jī)等過程。妊娠免疫涉及到妊娠識(shí)別和子宮容受態(tài)形成，是所有哺乳動(dòng)物共同存在的自然現(xiàn)象。妊娠識(shí)別主要由主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ(MHC-Ⅰ)所介導(dǎo)和觸發(fā)。
　　 奶牛的MHC稱為牛白細(xì)胞抗原(BoLA)。BoLA-Ⅰ類分子分為典型性的BoLA-Ⅰ a和非典型性的BoLA-Ⅰ

2、b。BoLA-Ⅰ a具有高度的多態(tài)性。在妊娠過程中，構(gòu)成胎盤最外層的滋養(yǎng)層細(xì)胞典型性BoLA-Ⅰ a抗原的表達(dá)調(diào)控是接受同種半異體母體免疫的關(guān)鍵。BoLA-A在奶牛妊娠的3個(gè)時(shí)期的母體外血液中性粒細(xì)胞中均表現(xiàn)為高表達(dá)，且以妊娠中期最高;BoLA-A在初生犢牛耳組織中極高表達(dá)，但在凋亡的胎兒胎盤中幾乎不表達(dá)。在奶牛圍植入床早期IFN-τ對(duì)奶牛子宮上皮細(xì)胞BoLA-A的表達(dá)具有調(diào)控作用。因此對(duì)BoLA-A的研究，有助于從分子通路和功能研究等

3、方面部分揭示BoLA-(Ⅰ)調(diào)節(jié)妊娠免疫形成的分子機(jī)理。本研究取得的主要結(jié)果如下:
　　 (1) BoLA-A的克隆及原核表達(dá)
　　 根據(jù)GenBank上公布的BoLA-A序列設(shè)計(jì)引物，提取奶牛子宮上皮組織mRNA，利用RT-PCR方法擴(kuò)增獲得BoLA-A片段，大小1092bp，回收后連接到載體PET-28a上，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR、酶切鑒定及序列測(cè)定，與GenBank中登錄號(hào)為AC000180的BoLA-A同源性為99

4、％，進(jìn)一步分析序列，結(jié)果顯示克隆序列與公布的序列相比突變1個(gè)堿基，但為同義突變，表示成功克隆該基因。構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞中，在37℃，IPTG0.4mmol/L，誘導(dǎo)4h后，融合蛋白His-A在分子量約44kDa處出現(xiàn)明顯的表達(dá)帶，并主要以包涵體的形式出現(xiàn)。
　　 (2) BoLA-A多克隆抗體的制備
　　 利用純化的融合蛋白His-A作為免疫原，按照設(shè)計(jì)好的免疫程序免疫家兔，成功制備了兔抗牛BoLA

5、-A高免血清，用間接ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)高達(dá)1∶256000，抗血清Western blot檢測(cè)子宮上皮細(xì)胞中BoLA-A的表達(dá)，特異性良好。
　　 (3) Western blot檢測(cè)IFN-τ調(diào)控子宮上皮細(xì)胞中BoLA-A的表達(dá)
　　 根據(jù)BoLA-A定量結(jié)果和試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，設(shè)置奶牛子宮上皮細(xì)胞密度5×105個(gè)/mL作為IFN-τ對(duì)BoLA-A表達(dá)干預(yù)試驗(yàn)的模型，IFN-τ濃度為100ng/ml。培養(yǎng)時(shí)間為6

6、h、12h。選擇6h，12h組和對(duì)照組(未添加IFN-τ)作為試驗(yàn)對(duì)象，Western blot檢測(cè)，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。結(jié)果顯示:在培養(yǎng)6h內(nèi)，IFN-τ抑制了奶牛子宮上皮細(xì)胞BoLA-A蛋白的表達(dá)，而到了培養(yǎng)12h時(shí)，奶牛子宮上皮細(xì)胞BoLA-A的表達(dá)量與對(duì)照組相比卻增加了。結(jié)果與IFN-τ調(diào)控BoLA-A基因表達(dá)的定量結(jié)果一致。但是數(shù)值之間的相關(guān)性有多大，有待進(jìn)一步的探討。
　　 (4) SABC法

7、檢測(cè)BoLA-A在奶牛主要組織細(xì)胞中的分布
　　 采用SABC法研究BoLA-A在奶牛肝臟、脾臟、子宮上皮組織和卵巢中的分布情況。結(jié)果顯示:BoLA-A在奶牛肝臟、脾臟、子宮上皮組織和卵巢中均表達(dá)，且在脾臟、肝臟組織中陽性信號(hào)明顯，部分免疫細(xì)胞陽性信號(hào)明顯。而以PBS作為空白對(duì)照未檢測(cè)到陽性信號(hào)。
　　 結(jié)論:檢測(cè)IFN-τ調(diào)控奶牛子宮上皮細(xì)胞表達(dá)BoLA-A蛋白，結(jié)果與BoLA-A表達(dá)的基因定量結(jié)果一致;發(fā)現(xiàn)BoLA-