奶牛MIC1表達檢測及其在主要組織細胞分布研究.pdf

1、繁殖是奶牛產業(yè)中最重要的環(huán)節(jié)。奶牛繁殖不僅影響著奶牛的數量和質量，還與奶牛的生產性能及經濟效益密切相關。各種原因造成的早期胚胎流失，特別是著床期胚胎流失是奶牛繁殖失敗最主要原因。其中，母胎界面的“同種半導體免疫”在胚胎著床中至關重要。主要組織相容性復合體通過直接或間接免疫，影響配子品質和胚胎發(fā)育。MHC-Ⅰ蛋白的正常表達在動物妊娠建立、維持和分娩中具有決定性的免疫調節(jié)作用。
　　 奶牛主要組織相容性復合體Ⅰα鏈相關蛋白(MIC1

2、)屬于非典型MHC-Ⅰ，是自然殺傷細胞(NK細胞)受體NKG2D的配體，位于第23號染色體的MHC-Ⅰ區(qū)域內。MIC1蛋白在上皮細胞、移植細胞和腫瘤細胞中表達;熱應激可激發(fā)上皮細胞表達MIC1蛋白。MIC1蛋白的表達將激活NK細胞，MIC1只有與NKG2D受體結合才能激活NK細胞殺傷活性。IFN-τ屬于Ⅰ型干擾素家族，是反芻動物胚胎滋養(yǎng)層細胞分泌產生的一類糖蛋白，具有維持黃體功能、建立正常妊娠、傳遞早期胚胎信號等功能，在胚胎著床過程中發(fā)

3、揮重要作用?；谶@些特點，我們推測IFN-τ對奶牛子宮上皮細胞MIC1的表達具有調控作用。
　　 本研究通過重組DNA和基因表達技術，利用制備的兔抗牛MIC1多克隆抗體，采用Western blot及免疫組織化學方法研究了MIC1蛋白在奶牛主要組織以及奶牛子宮上皮細胞上的表達及分布情況，為今后進一步開展奶牛子宮上皮細胞上表達MIC1功能研究及應用提供科學依據。本研究取得的主要結果如下:
　　 1.奶牛MIC1的克隆

4、>　　 根據Genbank的MIC1的CDS序列，設計了一對引物。以奶牛子宮組織為材料提取總RNA;應用RT-PCR擴增MIC1 CDS序列;瓊脂糖凝膠電泳顯示目的片段大小約為896bp;對所得到的MIC1進行PCR擴增，分別用Bam H（I）和XhoⅠ進行雙酶切鑒定及序列測定，與GenBank中登錄號為NM001127317.1的奶牛MIC1基因同源性為98％，氨基酸同源性為100％。
　　 2.奶牛MIC1的克隆與表達

5、r>　　 利用PCR克隆得到MIC1片段，將目的基因分別連接到載體pGEX-4T-1上構建重組原核表達質粒，并成功在大腸桿菌BL21中獲得了表達;表達產物通過 SDS-PAGE分析，結果顯示在分子量為63KD處出現蛋白條帶，與目的融合蛋白GST-MIC1分子量大小相符。
　　 3.多克隆抗體的制備及純化
　　 將純化后的融合蛋白GST-MIC1作為免疫原，免疫家兔，成功制備了兔抗牛MIC1高免血清，采用間接ELISA法

6、檢測血清抗體效價高達1∶64000，并采用親和層析法對所獲得的高免血清進行了純化。
　　 4.應用Western blot的方法檢測奶牛子宮上皮細胞在IFN-τ作用下的差異性表達
　　 利用制備的兔抗奶牛MIC1高免血清，采用Western blot方法檢測IFN-τ在不同濃度及作用時間下對奶牛子宮上皮細胞MIC1蛋白的表達情況。結果顯示，不同濃度、時間IFN-τ對奶牛子宮上皮細胞MIC1蛋白表達有所不同，且IFN-τ下

7、調MIC1蛋白在奶牛子宮上皮細胞上的表達。
　　 5.應用免疫組織化學方法檢測奶牛主要組織中的表達與分布
　　 利用純化的兔抗奶牛多克隆抗體建立了奶牛肝臟、脾臟、子宮、卵巢MIC1蛋白表達的免疫組織化學檢測方法。結果顯示，MIC1蛋白在肝臟和脾臟中表達呈弱陽性，在卵巢和子宮中表達陽性率極高，尤在上皮組織中的表達量最高，說明MIC1表達具有選擇性。
　　 結論:應用基因克隆表達技術和抗體制備技術我們成功地制備了奶牛