雙生病毒DNA1分子誘導(dǎo)的基因沉默體系的建立及其應(yīng)用.pdf

1、病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virusinducedgenesilencing，VIGS)是指攜帶一段植物功能基因cDNA的病毒載體侵染植物后誘導(dǎo)植物功能基因發(fā)生沉默，通過產(chǎn)生的表型或生理指標(biāo)變化來反映該基因功能的一種方法。本文利用煙草曲莖病毒(TbCSV)DNA1衛(wèi)星構(gòu)建了一種新型的基因沉默載體2mDNA1。 該載體能與同源輔助病毒一起侵染煙草植物，可以抑制轉(zhuǎn)基因GFP和內(nèi)源基因，Su的表達，產(chǎn)生明顯的表型突變。利用2mDNA1還可以

2、與異源雙生病毒中國番茄黃化曲葉病毒(TYLCCNV)在植物上建立有效的基因沉默體系。 該體系不僅可以抑制轉(zhuǎn)基因GFP的表達，也可以抑制內(nèi)源基因Su的表達，并且不產(chǎn)生任何的病毒癥狀。它可以誘導(dǎo)分生組織特異性表達和胚胎致死的PCNA基因發(fā)生沉默；可以在矮牽?；ㄉ铣聊珻HS基因；并且該體系也可以同時抑制兩個基因的表達；在該載體上插入170bp-1155bp的片段都可以誘導(dǎo)有效的基因沉默；此外，它在所有已測定的6種寄主植物都能誘導(dǎo)高效的

3、基因沉默。 因為DNA1能夠與不同的輔助病毒相伴隨，擴大了DNA1的寄主范圍，使得DNA1能夠在更多的寄主上進行功能基因的研究。利用2mDNA1和TbCSV對其在普通煙中的沉默體系進行了優(yōu)化，優(yōu)化后的沉默體系不僅能夠高效沉默轉(zhuǎn)基因普通煙，也能在多個普通煙品種中高效沉默植物內(nèi)源基因Su發(fā)生沉默，并且沉默效果持久，沉默可以在18-32℃溫度下誘導(dǎo)。 利用DNA1沉默載體，開展了基因功能的研究。從本氏煙擴增到TOM類寄主因子N

4、bTOM1和NbTOM3的基因片段，通過沉默研究證明NbTOM1和NbTOM3的沉默能夠降低TMV的復(fù)制，但是只有同時沉默NbTOM1和NbTOM3兩個基因才能夠完全抑制TMV的復(fù)制，表明NbTOM1和NbTOM3是TMV復(fù)制所需的寄主因子。利用TbCSV和2mDNA1研究了普通煙NtEDS1基因在N基因介導(dǎo)的抗TMV中的作用。 當(dāng)NtEDS1被沉默后，TMV在含N基因普通煙中不再產(chǎn)生過敏性反應(yīng)(HR)，而表現(xiàn)出TMV系統(tǒng)侵染的

5、病毒癥狀。證明了NtEDS1在TMV誘導(dǎo)的HR反應(yīng)中有著重要作用，這是利用VIGS在普通煙中研究抗病基因的首次報道。利用2mDNA1和TYLCCNV的沉默體系初步研究了本氏煙中葉片發(fā)育相關(guān)基因NbPHAN的功能。當(dāng)NbPHAN被沉默后葉片發(fā)育產(chǎn)生明顯的改變。葉片背腹極性改變，葉片皺縮、下卷并在葉片上表面產(chǎn)生耳突。 全基因比對發(fā)現(xiàn)NbPHAN是典型的AS1/PHAN類的基因，包含保守的MYB核酸結(jié)合域以及C端的CTD結(jié)構(gòu)域。酵母雙