兩種雙生病毒TYLCNV和TbCSV及其衛(wèi)星DNA的分子變異.pdf

1、煙草曲莖病毒(Tobacco curly shoot virus，TbCSV)和中國番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellowleaf curl China virus，TYLCCNV)是在我國云南廣泛發(fā)生的菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)病毒，伴隨衛(wèi)星DNAβ(TbCSB和TYLCCNB)，在煙草和番茄上已造成嚴重危害。已有研究表明TbCSV/TbCSB和TYLCCNV/TYLCCNB這兩類病害復合體具有不同的致病機理。

2、衛(wèi)星TYLCCNB為輔助病毒TYLCCNV引起典型癥狀所必需的致病決定因子，且二者在田間具有緊密的伴隨關系;與之不同，TbCSB能加重TbCSV引起的癥狀但并不是其致病所必需，田間僅部分TbCSV分離物伴隨有衛(wèi)星DNAβ。為了進一步明確這兩種雙生病毒/DNAβ病害復合體在我國的發(fā)生、分布、自然寄主及變異進化規(guī)律，本文利用TbCSV和TYLCCNV的特異引物對采自我國云南、四川和廣東等8個省份的田間表現(xiàn)雙生病毒典型癥狀的11種作物及14種

3、雜革共306份樣本進行了PCR鑒定，分析了部分分離物全基因組結構及群體遺傳多樣性，并對這兩種病毒及其伴隨衛(wèi)星種群結構和變異進行了研究。
　　 PCR檢測結果表明，在利用雙生病毒簡并引物PA/PB檢測的306份樣本中有235份樣本呈陽性，其中有67份樣品受TYLCCNV侵染，20份樣品受TbCSV侵染，這兩種病毒的復合侵染占陽性樣品數(shù)的1.3％。在云南昭通、楚雄、保山、文山、紅河及四川攀枝花的煙草、番茄、賽葵、錦葵和勝紅薊等5種寄

4、主上檢測到TYLCCNV，TbCSV在云南德宏勝紅薊上普遍發(fā)生，另在云南的煙草、紫茉莉和四川辣椒上也檢測到該病毒，而在廣東、廣西及福建等6個省份的作物及雜草上均沒有檢測到這兩種病毒，表明TYLCCNV的分布和寄主范圍比TbCSV更廣泛。利用雙生病毒伴隨衛(wèi)星DNAβ的通用引物β01/β02進行PCR擴增發(fā)現(xiàn)，TYLCCNV分離物普遍伴隨衛(wèi)星分子，共檢測到TYLCCNB、MYVYNB及MYVB等3種衛(wèi)星DNAβ，TbCSV僅部分分離物伴隨衛(wèi)

5、星分子DNAβ，分別為TbCSB和TYLCCNB。
　　 分別選取來源于不同地區(qū)和不同寄主的6個TbCSV和23個TYLCCNV分離物及其伴隨衛(wèi)星進行全基因組測序，并對這兩種病毒的群體遺傳多樣性進行分析。結果表明，兩種病毒的自然種群均具有豐富的種群結構，TYLCCNV的群體遺傳多樣性水平高于TbCSV，兩種病毒各區(qū)段的進化呈現(xiàn)不均衡性。利用重組分析軟件RDP3對本研究所得及GenBank中已登錄的這兩種病毒分離物序列進行重組分析

6、，結果顯示重組事件在TYLCCNV各分離物中發(fā)生較頻繁，在20個TYLCCNV分離物中共檢測到9個重組事件，其重組主要集中在IR和AC1區(qū)，在TbCSV分離物中未檢測到重組事件發(fā)生?；赥YLCCNVAV1序列，利用DnaSP對病毒種群進行中性檢測和誤配分析，對不同寄主來源或地理來源的病毒種群的歷史概況及發(fā)展動態(tài)的分析表明，TYLCCNV在云南和四川的煙草、番茄和賽葵等寄主上已形成穩(wěn)定的種群并呈擴張的趨勢。系統(tǒng)進化分析表明，對同種病毒而

7、言，其地理差異性對其進化的貢獻在一定程度上高于寄主差異性。
　　 本研究以TbCSV-Y35分離物(Y35A)、TYLCCNV-Y10分離物(Y10A)及其衛(wèi)星分子Y35β及Y10β為研究對象，在實驗條件下接種Y35A+Y35β及Y10A+Y10β，分析接種后不同時間段寄主本氏煙和心葉煙內病毒的種群結構，并比較了兩種病毒在不同寄主中的分子變異水平。結果表明Y35A在心葉煙中種群突變克隆百分率為8.33％，種群突變頻率為6.1×1

8、0-5;在本氏煙中種群突變克隆百分率和種群突變頻率分別為14.3％和1.2×10-4;而Y10A在心葉煙中種群突變克隆百分率為25.0％，種群突變頻率為2.2×10-4;本氏煙種群的突變克隆百分率為41.5％，種群突變頻率為4.3×10-4，表明TbCSV突變水平略低于TYLCCNV。為進一步明確病毒自然種群的遺傳結構特點，分析了田間受TbCSV或TYLCCNV自然感染的寄主中的病毒群體變異，TbCSV種群突變頻率為2.8×10-4，T

9、YLCCNV種群突變頻率為6.5×10-5-4.5×10-4，與病毒實驗種群的變異水平相當。對這兩種病毒種群變異數(shù)據(jù)的分析表明，突變在病毒的編碼區(qū)及非編碼區(qū)均有發(fā)生，且IR區(qū)變異最大;在本氏煙和心葉煙中，堿基突變類型存在差異，但均以堿基替代類型為主。兩種病毒在本氏煙中種群突變均高于心葉煙種群，表明兩種病毒在進化過程中所面臨的選擇壓力不同，寄主在病毒的進化過程中可能具有重要作用。
　　 已有研究表明衛(wèi)星DNAβ與其同源輔助病毒是共

10、進化的，為了明確衛(wèi)星DNAβ是否具有與輔助病毒相似的變異水平，本研究對這兩種衛(wèi)星即Y35β和Y10β分別伴隨同源或異源輔助病毒時在本氏煙和心葉煙中的種群結構與突變頻率進行了分析。結果發(fā)現(xiàn)，與輔助病毒相比，衛(wèi)星DNAβ具有更豐富的種群遺傳結構。伴隨同源輔助病毒時，Y35β的平均突變頻率為4.5×10-4，突變克隆百分率為43.6％;Y10β的平均突變頻率為1.5×10-3，突變克隆百分率為93.3％，表明Y10β變異水平高于Y35β。當伴

11、隨異源輔助病毒時，Y10β所有的克隆均發(fā)生了不同程度的突變，突變克隆百分比為100％，其突變頻率為1.9×10-3，變異水平略高于其伴隨同源輔助病毒。就同種衛(wèi)星而言，變異水平在不同的寄主中存在差異。變異類型和分布特點分析表明，除堿基替代外，還檢測到大量的堿基插入與缺失，尤其是在Y10β的A-rich區(qū)888-901這一區(qū)段出現(xiàn)較多的A或G堿基的插入與缺失，而在Y35β種群內則較多的觀察到G→T、A→C、T→A突變，堿基的插入與缺失突變比