侵染廣東黃秋葵的雙生病毒分子特征及其侵染性克隆構(gòu)建.pdf

1、黃秋葵黃脈曲葉病是我國新發(fā)生的一種由煙粉虱傳播的病害，田間病株典型癥狀表現(xiàn)為植株矮化，葉片向下或向上卷曲，葉質(zhì)脆硬，葉脈黃化，在葉片正面形成網(wǎng)絡(luò)狀，在葉背面葉脈腫大突起明顯，病株幼葉小且向下卷曲，甚至整片幼葉黃化。田間病株率高達(dá)60％以上。
　　 本研究對分離自黃秋葵黃脈曲葉病株的病毒分離物分子特征進(jìn)行了研究，并構(gòu)建了該病毒及其衛(wèi)星分子的侵染性克隆，取得了如下進(jìn)展：
　　 應(yīng)用雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬病毒特異簡并引物

2、AV494和C0PR，對來自廣東的黃秋葵黃脈曲葉病樣進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示，從這些病樣中均能擴(kuò)增到預(yù)期大小為570bp的特異片段，說明廣東黃秋葵黃脈曲葉病中存在菜豆金色花葉病毒屬病毒。
　　 對分離自廣東黃秋葵黃脈曲葉病株的病毒分離物Okra06基因組進(jìn)行了克隆及序列分析，結(jié)果表明，該病毒基因組僅含有A組分（DNA-A），不含B組分（DNA-B）；其DNA-A為單鏈環(huán)狀，全長為2737 nt，推導(dǎo)編碼6個ORF，分別是位于病毒

3、鏈上的AVl、AV2及位于互補(bǔ)鏈上的AC1、4C2、AC3和AC4，在AV2與AC1之間的非編碼區(qū)（IR）中含有一個11nt莖和11nt環(huán)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)及保守序列TAATATTAC。該組分與木爾坦棉花曲葉病毒（Cotton leaf curl Multan virus，CLCuMV）分離物G6的同源率最高，為99％；6個ORF與CLCuMV分離物G6的同源率分別為100％、100％、99.6％、99.8％、100％和99.7％。系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

4、分析顯示，Okra06與CLCuMV各分離物的親緣關(guān)系最近，聚類在一起形成一個分支，而與其它雙生病毒的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。這些結(jié)果證明，侵染廣東黃秋葵的病毒分離物Okra06是CLCuMV一個分離物，且該分離物與引起廣東朱槿曲葉病的CLCuMV是同一個株系。
　　 利用菜豆金色花葉病毒屬衛(wèi)星DNA分子（DNAβ）特異引物β01和β02，從分離物Okra06中擴(kuò)增到1個DNAβ分子?；蚩寺∨c序列分析顯示，該DNAβ全長為1346n

5、t，推導(dǎo)其互補(bǔ)鏈上編碼一個ORF（C1），該序列與CI，CuMV分離物G6 DNAβ的同源率也最高（99％）。系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果表明，Okra06與CLCuMV分離物G6和GX08的DNAβ親緣關(guān)系最近，三者形成一個獨(dú)立分支：進(jìn)一步與CLCuMV、CLCuV的DNAβ聚類成一個較大分支，而與伴隨菜豆金色花葉病毒屬的其它DNAβ親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。
　　 通過基因克隆技術(shù)，成功構(gòu)建了CLCuMV-[Okra06]DNA-A侵染性克

6、隆рBinPLUS-1.85A和CLCuMV-[Okra06]DNAβ侵染性克隆рBinPLUS-2β。農(nóng)桿菌注射接種本生煙的結(jié)果顯示，рBinPLUS-1.85A單獨(dú)接種的植株不表現(xiàn)明顯癥狀，但PCR可檢測到CLCuMV-[Okra06]的存在，說明該病毒可以系統(tǒng)侵染本生煙但癥狀不明顯；рBinPLUS-2β單獨(dú)接種植株表現(xiàn)輕微的曲葉癥狀，但在接種植株中PCR未檢測DNAβ分子的存在，說明DNAβ依賴病毒DNA-A才能復(fù)制；而兩者共同