雙生病毒衛(wèi)星DNA編碼的βC1蛋白的生化特性研究.pdf

1、菜豆金色花葉病毒屬病毒(begomoviruses)是一類(lèi)具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的單鏈環(huán)狀DNA植物病毒。近年來(lái),隨著B(niǎo)型和Q型煙粉虱迅速在世界各地?cái)U(kuò)散begomoviruses也急劇全球蔓延。βC1蛋白是單組份begomoviruses相伴隨的衛(wèi)星DNA分子編碼的一個(gè)具有多種功能的蛋白,包括癥狀決定因子、RNA沉默抑制子和運(yùn)動(dòng)蛋白等。為了進(jìn)一步弄清βC1蛋白的功能,本論文以中國(guó)番茄黃曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curl C

2、hina virus,TYLCCNV)Y10分離物相伴隨的betasatellite編碼的βC1蛋白(Y10βC1)為研究對(duì)象對(duì)它的生理、生化性質(zhì)等進(jìn)行了研究。
　　 用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了Y10βC1蛋白,經(jīng)Ni-NTA Agrose、凝膠過(guò)濾和Heparin親和層析純化了Y10βC1重組蛋白。利用凝膠過(guò)濾層析和戊二醛介導(dǎo)的化學(xué)交聯(lián)法對(duì)Y10βC1的多聚狀態(tài)進(jìn)行了體外分析,發(fā)現(xiàn)Y10βC1以多聚體的形式存在于溶液中.非還原SDS

3、-PAGE結(jié)果表明Y10βC1的多聚化與二硫鍵無(wú)關(guān)。以雙分子熒互補(bǔ)試驗(yàn)(BiFC)和in vivo化學(xué)交聯(lián)法對(duì)Y10βC1的多聚狀態(tài)進(jìn)行了體內(nèi)分析,發(fā)現(xiàn)Y10βC1以多聚體的形式存在于本氏煙(Nicotianabenthamiana)細(xì)胞質(zhì)中,但是細(xì)胞核中可能以單體或低聚態(tài)存在,說(shuō)明βC1蛋白可能在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中采取了不同的構(gòu)象以執(zhí)行不同的功能。用PredictProtein等軟件對(duì)Y10βC1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)Y10βC

4、1包括5個(gè)β折疊片和2個(gè)α螺旋,其中4個(gè)β折疊片位于Y10βC1蛋白的氨基端結(jié)構(gòu)域中,而2個(gè)α螺旋和最后1個(gè)β折疊片位于Y10βC1蛋白的碳端結(jié)構(gòu)域中碳端結(jié)構(gòu)域中。以Y10βC1蛋白的氨基端結(jié)構(gòu)域和碳端結(jié)構(gòu)域突變體進(jìn)行BiFC發(fā)現(xiàn)Y10βC1的多聚化由碳端結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)α螺旋介導(dǎo)。PVX侵染實(shí)驗(yàn)表明多聚化是Y10βC1蛋白誘導(dǎo)begomovirus類(lèi)似癥狀所必須的,同時(shí)僅僅多聚化結(jié)構(gòu)域不能誘導(dǎo)產(chǎn)生begomovirus類(lèi)似癥狀。生物信息

5、學(xué)分析和凝膠過(guò)濾層析結(jié)果表明多聚化是除有betasatellite編碼的βC1蛋白的一個(gè)共同特性,并提出了兩和可能的多聚化模型。利用電泳遷移率變動(dòng)試驗(yàn)(EMSA)和核酸酶-交聯(lián)實(shí)驗(yàn)對(duì)Y10βC1蛋白的RNA結(jié)合特性進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)Y10βC1蛋白可以結(jié)合單鏈RNA;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)沉默誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明Y10βC1蛋白不能抑制dsRNA激發(fā)的RNA沉默,這些結(jié)果表明Y10βC1蛋白可能通過(guò)全新的機(jī)制抑制RNA沉默。
　　 最后,利

6、用蛋白質(zhì)結(jié)晶的手段嘗試了Y10βC1、氨基端整合麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)的βC1(MBP-Y10βC1)、Y10βC1與DNA、Y10βC1與AS1、Y10βC1與AS1與DNA共結(jié)晶,且獲得了MBP-Y10βC1的晶體并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)的解析,結(jié)果表明晶體中只含有MBP蛋白而沒(méi)有Y10βC1,說(shuō)明Y10βC1不穩(wěn)定。此外,獲得了AS1與DNA復(fù)合體的晶體,但還需要對(duì)結(jié)晶條件進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化以提高晶體的分辨率。
　　 本研兗發(fā)現(xiàn)βC1