中國(guó)番茄黃曲葉病毒衛(wèi)星編碼的βC1蛋白與煙草寄主因子NtRFP1的互作研究.pdf

1、中國(guó)番茄黃曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curl China virus，TYLCCNV)是典型的單組份雙生病毒，其伴隨的衛(wèi)星DNA(TYLCCNB)是該病毒在寄主植物上引起癥狀所必需的。研究發(fā)現(xiàn)，TYLCCNB的互補(bǔ)鏈上所編碼βC1蛋白是一個(gè)癥狀決定因子和RNA沉默抑制子。
　　為深入了解TYLCCNV/TYLCCNB在寄主植物上的致病機(jī)理以及植物在抵抗病毒侵染過(guò)程中所產(chǎn)生的防御反應(yīng)。本研究對(duì)TYLCCNBβC1

2、與普通煙寄主因子RING finger蛋白NtRFP1的互作展開了研究。酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TYLCCNBβC1能與NtRFP1發(fā)生互作。序列分析表明，普通煙NtRFP1基因全長(zhǎng)為1455 bp，預(yù)測(cè)編碼一個(gè)485aa的蛋白。另外，利用DNAStar軟件對(duì)普通煙NtRFP1蛋白進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，其與辣椒CaRFP1和番茄SlRFP1等都具有很高的同源性，分別達(dá)到86.4％和83.4％。進(jìn)一步通過(guò)InterProScan軟

3、件（http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/）對(duì)NtRFP1蛋白的保守功能域進(jìn)行了分析，結(jié)果表明NtRFP1蛋白主要含有VWA(von Willebrand factor(vWF) type Adomain)和RING(RING finger domain)兩個(gè)保守的功能結(jié)構(gòu)域。根據(jù)NtRFP1的二級(jí)結(jié)構(gòu)與保守功能域分別設(shè)計(jì)了4個(gè)NtRFP1突變體用于分析其與βC1蛋白互作的區(qū)域，結(jié)果表明NtRF

4、P1蛋白的RING結(jié)構(gòu)域（第443-475位氨基酸）是與βC1蛋白互作的位點(diǎn)。
　　通過(guò)real-time RT-PCR測(cè)定NtRFP1 mRNA在普通煙中表達(dá)的組織特異性，結(jié)果表明NtRFP1 mRNA在種子中表達(dá)量最高，其次是在根和花中，而在葉子和莖中表達(dá)量最低。另外，TYLCCNV/TYLCCNB的侵染能上調(diào)NtRFP1 mRNA在普通煙葉片中的積累。通過(guò)亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)NtRFP1蛋白主要定位于煙草表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞

5、核中。
　　為深入研究NtRFP1與βC1體內(nèi)互作的生物學(xué)意義，我們采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法對(duì)普通煙進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得具有卡那霉素抗性的T0代普通煙植株，通過(guò)PCR篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，并利用real-time RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中NtRFP mRNA在細(xì)胞內(nèi)的積累水平，獲得過(guò)表達(dá)NtRFP1基因[NtRFP1(+)]或沉默NtRFP1基因[NtRFP1(-)]的轉(zhuǎn)基因普通煙植株。為研究NtRFP1蛋白對(duì)病毒誘導(dǎo)的癥狀以及植

6、物體內(nèi)病毒DNA積累量的影響，對(duì)T1代具有卡那霉素抗性的NtRFP1(+)、NtRFP1(-)及野生型(WT)普通煙注射接種TYLCCNV/TYLCCNB并觀察癥狀。結(jié)果表明，與WT普通煙相比，NtRFP1(+)植株表現(xiàn)出輕微的癥狀，但病毒DNA積累量高;而NtRFP1(-)植株癥狀表型嚴(yán)重，但病毒DNA積累量低。表明NtRFP1蛋白能減輕病毒誘導(dǎo)的癥狀并負(fù)調(diào)控植物對(duì)病毒的積累。
　　利用PVX載體(pGR106)構(gòu)建了GFP、N

7、tRFP1以及NtRFP1 E3 ligase-dead突變體NtRFP1 H459Y的重組表達(dá)載體，并分別與pGR106-βC1浸潤(rùn)共接種本氏煙。共表達(dá)βC1與NtRFP1蛋白的植株表現(xiàn)出輕微的癥狀，而共表達(dá)βC1和GFP或NtRFP1 H459Y蛋白的植株癥狀表型嚴(yán)重。通過(guò)免疫印跡分析，共表達(dá)NtRFP1樣品中的βC1蛋白含量明顯比對(duì)照組共表達(dá)GFP樣品中βC1蛋白含量少，幾乎檢測(cè)不到βC1蛋白;而共表達(dá)NtRFP1 H459Y樣品