中國番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星DNA編碼的βC1與番茄寄主因子SISnRKI的互作機制研究.pdf

1、中國番茄黃曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curl China virus，TYLCCNV)是單組份雙生病毒，與其相伴隨的衛(wèi)星betasatellite分子--TYLCCNB是該病毒在自然寄主上引起典型癥狀所必需的。進一步研究發(fā)現(xiàn)TYLCCNB互補鏈上所編碼的唯一的蛋白--βCl是一個RNA沉默抑制子和癥狀決定因子。為弄清βCl蛋白致病的分子機理，本論文對TYLCCNBβCl蛋白與番茄寄主因子的互作進行了研究。
　　

2、 以TYLCCNBβCl蛋白為誘餌，利用酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two hybridsystem，Y2H)從番茄cDNA文庫中篩選與βCl蛋白互作的番茄寄主因子。將已構建好的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-βCl、番茄cDNA和線性化的質(zhì)粒pGADT7-Rec共轉化酵母菌株AH109，通過三缺營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和x-α-gal實驗篩選，并進一步通過回轉驗證，最終確定SlSnRK1蛋白為與TYLCCNBβCl互作的番茄寄主因子。構建了雙分子熒光

3、互補實驗(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)的重組質(zhì)粒pβCl-YFPN和pSlSnRK1-YFPC，BiFC證實SlSnRK1和TYLCCNBβCl可以在煙草表皮細胞中互作，并且互作主要發(fā)生在細胞質(zhì)中。
　　 序列分析表明，番茄SlSnRK1屬于SnRK1復合體的α亞基，SlSnRK1基因全長為1545 bp，預測編碼一個514 aa(約58，824 kD)的蛋白(Ge

4、nBank登錄號AAF66639)。通過DNAStar軟件聚類分析發(fā)現(xiàn)番茄SlSnRK1蛋白與本氏煙SnRK1、普通煙NPK5的同源性及擬南芥的AKIN11等都有很高的同源性，分別為95％，87％和78％。進一步利用 InterProScan軟件(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/)分析了SlSnRK1的保守功能域，結果表明SlSnRK1蛋白主要含有絲/蘇氨酸激酶結構域(kinase dom

5、ain，KD)；泛素相關結構域(ubiquitin associated domain，UBA)；自我抑制序列(auto-inhibitorysequence，AIS)和C端與復合體形成有關的結構域(C-terminal domain，CTD)。
　　 在煙草表皮細胞中對SlSnRK1蛋白的亞細胞進行定位，利用農(nóng)桿菌浸潤法將SlSnRK1的N端融合有GFP的表達載體pCHF3-GFP-SlSnRK1在本氏煙葉片表皮細胞中進行瞬時

6、表達，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)SlSnRK1融合蛋白定位于煙草表皮細胞的細胞核和細胞質(zhì)中。
　　 利用特異性引物，以提取的番茄不同器官的總RNA為模板，通過半定量RT-PCR和real-time RT-PCR測定了SlSnRK1 mRNA表達的組織特異性，SlSnRK1的mRNA在花中積累量最高，在葉中次之，而在根和莖中的積累量都較低。此外，以提取的TYLCCNV/TYLCCNB侵染的番茄葉片和接種菌株EHA105的番茄葉片總R

7、NA為模板，通過real-time RT-PCR比較分析了SlSnRK1的mRNA積累量的差異，TYLCCNV在侵染早期能上調(diào)SlSnRK1 mRNA在番茄葉片中的積累，在顯癥期則對SlSnRK1 mRNA積累量無明顯的影響，而在侵染后期則又下調(diào)了SlSnRK1 mRNA在番茄葉片中的積累。
　　 利用野生型(wild type，WT)本氏煙和轉正義(sense)擬南芥SnRK1基因的轉基因本氏煙植株進行病毒侵染效率測定，結果發(fā)

8、現(xiàn)，與WT本氏煙相比，TYLCCNV/TYLCCNB侵染效率在轉基因過表達SnRK1的本氏煙中明顯下降，表明SnRK1可能參與了植物對病毒的防衛(wèi)反應。
　　 構建了βCl、SlSnRK1以及SlSnRK1 kinase-dead突變體SlSnRK1K48R的酵母表達載體，利用snf1缺失突變的酵母菌株△snf1 BY4741進行酵母互補實驗驗證βCl蛋白能否在酵母細胞內(nèi)抑制SlSnRK1的活性。在△snf1 BY4741酵母菌株

9、中單獨表達SlSnRK1或SlSnRK1K48R時，番茄SlSnRK1蛋白能互補酵母SNF1蛋白的功能，而失去激酶活性的SlSnRK1的kinase-dead突變體SlSnRK1K48R喪失了其互補的功能，但在△snf1 BY4741酵母菌株中共表達SlSnRK1和βCl蛋白時，βCl蛋白不能抑制SlSnRK1蛋白的互補活性，說明βCl蛋白不能抑制SlSnRK1的激酶活性。
　　 為了進一步了解TYLCCNBβCl與SlSnRK

10、1的互作機理，對TYLCCNBβCl和SlSnRK1的激酶結構域區(qū)段(含有激酶結構域和泛素相關結構域，簡稱SlSnRK1-KD)分別進行原核表達和純化，并用于體外磷酸化試驗。結果證實SlSnRK1-KD激酶能夠在體外條件下特異性磷酸化GST-βCl，對TYLCCNBβCl蛋白的氨基酸序列進行分析后發(fā)現(xiàn)，βCl33位的絲氨酸和78位的蘇氨酸很可能是SlSnRK1的磷酸化位點，針對這兩個位點分別設計了將兩個位點分別或同時突變?yōu)楸彼峄蛱於?/p>

11、酸的6個點突變。對上述點突變體蛋白與GST進行融合位絲氨酸和78位蘇氨酸進行突變都能夠明顯降低突變體的磷酸化水平，其中33位絲氨酸突變后對磷酸化的影響相對較大，而78位蘇氨酸突變后對磷酸化的影響相對較小，說明33位和78位均為SlSnRK1的磷酸化位點，但33位絲氨酸的磷酸化效率高于78位蘇氨酸。
　　 針對βCl蛋白的兩個主要磷酸化位點，構建了6個βCl突變的TYLCCNB突變體侵染性克隆，將突變體及其野生型TYLCCNB侵染