2013年新發(fā)生的番茄黃化曲葉病DNA-A組分分析及TYLCV編碼的C4蛋白與番茄互作因子篩選.pdf

1、番茄黃化曲葉病是番茄上一種重要的病毒病害，近年來該病的肆虐危害給我國番茄生產(chǎn)造成了巨大的損失。在江蘇，番茄黃化曲葉病最早于2007年出現(xiàn)發(fā)生危害報道，之后該病陸續(xù)擴散蔓延，成為限制當?shù)胤旬a(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素，導致該病的主要病原為番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)，典型癥狀包括葉片上卷、黃化等。
　　2013年，在江蘇南京番茄上發(fā)現(xiàn)一種新的番茄黃化曲葉病，與以往報道的番茄黃化曲葉病不同，該病在番茄上的主要癥狀表現(xiàn)為葉片皺縮、葉脈腫大及葉

2、背耳突。對其伴隨的粉虱傳雙生病毒進行了檢測，結(jié)果顯示該病常常伴隨一種粉虱傳雙生病毒，對其DNA-A組分進行了克隆和序列測定，BLAST及聚類分析發(fā)現(xiàn)，該病毒為番茄黃化曲葉病毒，結(jié)果顯示該病毒分離物為環(huán)狀單鏈DNA，全場2781個堿基，包括6個ORFs，分別編碼V1、V2、C1、C2、C3和C4。對其進行BLAST及聚類分析發(fā)現(xiàn)，該病毒為番茄黃化曲葉病毒，與以往報道的番茄黃化曲葉病毒江蘇分離物序列同源性非常高(＞99％)，未發(fā)現(xiàn)明顯的變異

3、/重組位點，但是該病的癥狀與以往報道的由TYLCV引起的番茄黃化曲葉病癥狀差別很大，懷疑可能還存在其他組分。
　　為了研究TYLCV編碼的C4基因功能及其在TYLCV侵染及致病過程中的作用機理，對TYLCV編碼的C4基因進行了克隆并構(gòu)建了酵母雙雜交載體pGBK-C4(無毒性及自激活現(xiàn)象)，以其為誘餌篩選番茄cDNA文庫，共計篩選到541個候選陽性克隆，對其中的210個克隆進行了序列測定，利用GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的番茄基因組信

4、息進行注釋，分析篩選到的互作基因編碼蛋白種類及ORF完整性，獲得10種C4互作蛋白:兩種熱激蛋白(Heat shock protein)、兩種核糖體蛋白（Ribosomal protein）、兩種Rubisco小亞基(Rubisco small subunit)、一種過氧化氫酶（Catalase）、一種金屬硫蛋白(Metallothionein)、一種乙酰輔酶A羧化酶載體運輸?shù)鞍?Biotin carboxyl carrierprote

5、in of acetyl-CoA carboxylase)和一種F-box蛋白(F-box protein)。
　　根據(jù)文庫篩選結(jié)果，從番茄體內(nèi)克隆了Rubisco蛋白小亞基(slRbCS)并對其與C4的互作進行了研究。slRbCS序列分析結(jié)果顯示其N端存在信號肽，所以分別構(gòu)建了slRbCS和△slRbCS（去除信號肽）的酵母雙雜交載體，在缺陷型培養(yǎng)基上研究其與pGBK-C4的互作，結(jié)果顯示slRbCS與△slRbCS都能與C4互