大豆花葉病毒半夏株系編碼的P1和6K1蛋白與寄主植物蛋白間的互作初步研究.pdf

1、半夏(Pinelliaternata)屬于天南星科(Araceae)植物，是重要的傳統(tǒng)中藥。近年來本實(shí)驗(yàn)室從浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所的半夏病葉中分離出與大豆花葉病毒相關(guān)的半夏病毒(SMV-P)，這是SMV侵染天南星科植物的首次報(bào)道。SMV-P的P1基因與大豆花葉病毒的同源性很小，而與芋花葉病毒(DsMV)的相似性卻達(dá)到60％左右。我們采集了14個(gè)地區(qū)的半夏，發(fā)現(xiàn)浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑所、上海植物園、湖北省武漢植物園、湖北省武漢市華中農(nóng)業(yè)

2、大學(xué)、河南省禹州市和江蘇省鹽城市射陽縣6個(gè)地區(qū)的半夏有SMV-P的侵染。通過測定這些分離物的P1基因序列發(fā)現(xiàn)各種半夏中的SMV-PP1基因序列并沒有十分明顯的地區(qū)差異，并且上述6個(gè)地區(qū)的SMV-P分離物的P1基因序列均與DsMV有較大的同源性(約為60％)，而與SMV的各種大豆分離物的同源性均很小(核苷酸38.3％-45.2％，氨基酸23.7％-31.9％)。這說明這種現(xiàn)象普遍存在于大豆花葉病毒半夏株系的病毒基因組中，暗示SMV-P可能

3、是SMV與DsMV的P1基因重組的產(chǎn)物。 本研究以pGEX-3X為表達(dá)載體，構(gòu)建了SMV-PP1基因及6K1基因的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)pLysE中大量表達(dá)，并免疫小鼠制備特異性抗血清。制備的SMV-PP1蛋白抗血清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的SMV-PP1蛋白的檢測，而6K1蛋白抗血清用于半夏病葉中的6K1蛋白的免疫膠體金標(biāo)記。 構(gòu)建了酵母雙雜交載體pGBKT7-(SMV-P)P1，并成功轉(zhuǎn)入酵母菌AH1

4、09。Westernblot分析表明SMV-P的P1蛋白在酵母體內(nèi)與BD蛋白融合表達(dá)，并排除對宿主細(xì)胞的毒害和自激活作用，可用于酵母雙雜交文庫的篩選。 用Trizol提取半夏總RNA，應(yīng)用SMART技術(shù)合成第一鏈cDNA，然后用5’和3’PCR引物進(jìn)行LD-PCR擴(kuò)增雙鏈cDNA，并與pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化酵母菌Y187，構(gòu)建半夏的酵母雙雜交cDNA文庫。經(jīng)檢測，所構(gòu)文庫的獨(dú)立克隆數(shù)為2.1×106，文庫滴度為3.1×108

5、，可作為文庫用于篩選。 將文庫菌Y187與AH109/pGBKT7-(SMV-P)P1接合后根據(jù)對3個(gè)報(bào)告基因ADE2、HIS3、MEL1的檢測篩選了4個(gè)陽性候選克隆。抽提陽性候選克隆的質(zhì)粒，PCR檢測文庫質(zhì)粒，結(jié)果4個(gè)陽性候選克隆的插入片段大小約為600bp左右，通過回轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步排除假陽性。最后對4個(gè)陽性克隆的文庫質(zhì)粒進(jìn)行測序，序列提交GeneBank分析后發(fā)現(xiàn)4個(gè)候選克隆的核苷酸序列相同，為光合作用電子傳遞鏈細(xì)胞色素b6/