大豆花葉病毒半夏株系編碼的P1和6K1蛋白與寄主植物蛋白間的互作初步研究.pdf

1、半夏(Pinelliaternata)屬于天南星科(Araceae)植物，是重要的傳統(tǒng)中藥。近年來本實驗室從浙江省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑研究所的半夏病葉中分離出與大豆花葉病毒相關的半夏病毒(SMV-P)，這是SMV侵染天南星科植物的首次報道。SMV-P的P1基因與大豆花葉病毒的同源性很小，而與芋花葉病毒(DsMV)的相似性卻達到60％左右。我們采集了14個地區(qū)的半夏，發(fā)現(xiàn)浙江省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑所、上海植物園、湖北省武漢植物園、湖北省武漢市華中農(nóng)業(yè)

2、大學、河南省禹州市和江蘇省鹽城市射陽縣6個地區(qū)的半夏有SMV-P的侵染。通過測定這些分離物的P1基因序列發(fā)現(xiàn)各種半夏中的SMV-PP1基因序列并沒有十分明顯的地區(qū)差異，并且上述6個地區(qū)的SMV-P分離物的P1基因序列均與DsMV有較大的同源性(約為60％)，而與SMV的各種大豆分離物的同源性均很小(核苷酸38.3％-45.2％，氨基酸23.7％-31.9％)。這說明這種現(xiàn)象普遍存在于大豆花葉病毒半夏株系的病毒基因組中，暗示SMV-P可能

3、是SMV與DsMV的P1基因重組的產(chǎn)物。 本研究以pGEX-3X為表達載體，構建了SMV-PP1基因及6K1基因的原核表達載體，在大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)pLysE中大量表達，并免疫小鼠制備特異性抗血清。制備的SMV-PP1蛋白抗血清用于后續(xù)實驗的SMV-PP1蛋白的檢測，而6K1蛋白抗血清用于半夏病葉中的6K1蛋白的免疫膠體金標記。 構建了酵母雙雜交載體pGBKT7-(SMV-P)P1，并成功轉(zhuǎn)入酵母菌AH1

4、09。Westernblot分析表明SMV-P的P1蛋白在酵母體內(nèi)與BD蛋白融合表達，并排除對宿主細胞的毒害和自激活作用，可用于酵母雙雜交文庫的篩選。 用Trizol提取半夏總RNA，應用SMART技術合成第一鏈cDNA，然后用5’和3’PCR引物進行LD-PCR擴增雙鏈cDNA，并與pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化酵母菌Y187，構建半夏的酵母雙雜交cDNA文庫。經(jīng)檢測，所構文庫的獨立克隆數(shù)為2.1×106，文庫滴度為3.1×108

5、，可作為文庫用于篩選。 將文庫菌Y187與AH109/pGBKT7-(SMV-P)P1接合后根據(jù)對3個報告基因ADE2、HIS3、MEL1的檢測篩選了4個陽性候選克隆。抽提陽性候選克隆的質(zhì)粒，PCR檢測文庫質(zhì)粒，結果4個陽性候選克隆的插入片段大小約為600bp左右，通過回轉(zhuǎn)實驗進一步排除假陽性。最后對4個陽性克隆的文庫質(zhì)粒進行測序，序列提交GeneBank分析后發(fā)現(xiàn)4個候選克隆的核苷酸序列相同，為光合作用電子傳遞鏈細胞色素b6/