大豆過表達(dá)鉬輔因子生物合成蛋白GmCnx1增強(qiáng)大豆花葉病毒抗性研究.pdf

1、大豆是我國重要的油料作物和高蛋白糧飼兼用作物。但目前大豆已經(jīng)成為國內(nèi)供需缺口最大的農(nóng)產(chǎn)品，我國的大豆產(chǎn)業(yè)也面臨著巨大的挑戰(zhàn)。大豆生長發(fā)育期間常受到病蟲害的危害，大豆花葉病毒病是我國南方地區(qū)常見的葉部病害之一，生產(chǎn)上常采用農(nóng)業(yè)防治、生物防治、化學(xué)防治等方法，但最直接有效的方法是育成抗花葉病毒病新種質(zhì)。采用常規(guī)育種方法常受種質(zhì)資源及時間長等限制，基因工程技術(shù)作為一種相對簡便、快捷、高效的育種手段。GmCnx1是從接種大豆花葉病毒抗病和感病品

2、種經(jīng)微陣列分析后克隆得到的與鉬輔因子合成相關(guān)的基因，與擬南芥AtCnx1基因相似。鉬輔因子生物合成蛋白，可與許多鉬酶結(jié)合發(fā)生生理和抗逆作用。本研究擬利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將GmCnx1（cofactor for nitrate reductase and xanthine dehydrogenase）基因轉(zhuǎn)入大豆中，明確GmCnx1的功能及抗花葉病毒病作用。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、臛mCnx1轉(zhuǎn)化植株的獲得。以大豆子葉節(jié)為外植體，b

3、ar基因作為篩選標(biāo)記基因，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將目的基因GmCnx1轉(zhuǎn)入大豆中，進(jìn)行4個批次實(shí)驗(yàn)，分別轉(zhuǎn)化外植體113、194、181和238個，獲得生根苗2、20、6和6株，共34株。批次生根率分別為1.77％、10.31％、3.31％和2.52％，平均生根率為4.68％。
　?、艷mCnx1轉(zhuǎn)化植株的鑒定。采用草丁膦涂抹法、bar試紙條法、PCR法對34株T0代生根苗進(jìn)行鑒定，其中轉(zhuǎn)基因陽性植株有27株，陰性植株為7株，進(jìn)一步

4、對T1代10株獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行Southern雜交檢測，結(jié)果表明除1號株系外，其余株系均為單拷貝株系。
　　⑶GmCnx1基因功能分析。選取10株獨(dú)立的轉(zhuǎn)化株系對T1代轉(zhuǎn)基因株系GmCnx1基因表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR測定，結(jié)果表明，GmCnx1在T1代轉(zhuǎn)基因植株葉部和根部表達(dá)量均有所上調(diào)，葉部GmCnx1基因表達(dá)量上調(diào)1.04-2.12倍，根部GmCnx1基因表達(dá)量上調(diào)1.55-3.89倍，其中轉(zhuǎn)基因10號和22號株系在兩個

5、部位的表達(dá)量上調(diào)幅度最大。對T1代轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行硝酸還原酶(nitrate reductase，NR)、乙醛氧化酶(aldehyde oxidase，AO)、黃嘌呤脫氫酶(xanthine dehydrogenase，XDH)和亞硫酸鹽氧化酶（sulphite oxidase，SO）活性檢測表明，NR在轉(zhuǎn)基因植株葉片中的活性（4.25μg g-1 h-1）約為非轉(zhuǎn)基因植株（1.62μg g-1 h-1）的2.6倍，AO在轉(zhuǎn)基因

6、植株葉片中的活性(30.00 pmol L-1)約為非轉(zhuǎn)基因植株（7.71 pmol L-1）的3.9倍，其中轉(zhuǎn)基因10號株系兩種鉬酶活性最高;XDH和SO與GmCnx1表達(dá)量無明顯關(guān)聯(lián)。此外，超表達(dá)GmCnx1基因還增強(qiáng)了大豆花葉病毒(soybeanmosaic virus, SMV)的抗性，摩擦接種SMV G1和G7不同株系花葉病毒表明，與非轉(zhuǎn)基因植株相比，超表達(dá)GmCnx1基因植株對兩種株系SMV的抗病性均有所提高;接種3周后DA