大豆花葉病毒膠體金免疫層析試紙條的制備及RT-LAMP檢測.pdf

1、大豆花葉病毒（Soybean mosaic virus，SMV）是一種在世界上很多國家廣泛分布并極具破壞性的植物病毒，會導致大豆嚴重減產(chǎn)和種質(zhì)衰退，每年都給很多國家?guī)砭薮蟮慕?jīng)濟損失，因此，建立一種快速檢測SMV的方法對于檢測和防控大豆花葉病毒的發(fā)生與流行是十分必要的。
　　本研究建立了兩種方法:一種為大豆花葉病毒一步免疫層析檢測法，該方法利用膠體金標記單克隆抗體（mAb）檢測植物樣品中SMV。一種為逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增(Reve

2、rse-transcription loop-mediated isothermal amplification)檢測大豆葉片和種子中的SMV的方法，兩種方法都實現(xiàn)了對SMV快速、準確的檢測。
　　SMV的免疫層析試紙條檢測:本研究利用原核表達方法體外表達大豆花葉病毒的外殼蛋白，采用腹腔免疫方式免疫小鼠，通過細胞融合技術(shù)獲得雜交瘤細胞株，成功制備4株SMV單克隆抗體。并采用雙抗體夾心模式，使用兩株不同特異性的單克隆抗體，制備免疫層

3、析試紙條。一株抗SMV單抗(mAb3E12C6)被固定到在硝酸纖維素膜檢測區(qū)域，而另一株抗SMV單抗（mAb4B8D9）偶聯(lián)到作為顯色劑的膠體金粒子上。然后將植物樣品溶液通過毛細管作用，與抗SMV IgG抗體在檢測區(qū)發(fā)生反應，使SMV滯留在檢測區(qū)域，從而出現(xiàn)紅色陽性結(jié)果，檢測方法快速方便，可在5分鐘內(nèi)出結(jié)果。制備的試紙條可以敏感且特異的檢測到大豆葉子和種子中攜帶的SMV。
　　SMV的RT-LAMP檢測:本研究根據(jù)GenBank數(shù)

4、據(jù)庫中大豆花葉病毒的外殼蛋白基因序列，設計并篩選到了SMV RT-LAMP特異性引物組，應用該引物組優(yōu)化了RT-LAMP反應參數(shù)，靈敏度實驗結(jié)果表明，RT-LAMP檢測SMV比普通RT-PCR靈敏度高出10～100倍。結(jié)合RNA粗提法，建立了一步法RT-LAMP快速、靈敏地檢測到植物葉片中的SMV。加入熒光染料SYBR GreenI則可在反應管中直接觀察檢測結(jié)果，實現(xiàn)了檢測的可視化。該RT-LAMP技術(shù)還可靈敏地檢測到大豆種子中攜帶的S