日糧能量水平對(duì)山羊瘤胃上皮生長(zhǎng)的影響及機(jī)理研究.pdf

1、前期研究報(bào)道高能量日糧促進(jìn)瘤胃上皮生長(zhǎng)可能與血漿IGF-1濃度升高、瘤胃上皮IGF1型受體數(shù)量增加有關(guān)，但機(jī)理不清楚。本文從整體動(dòng)物、瘤胃器官和組織以及細(xì)胞、分子等不同層次系統(tǒng)研究了日糧能量水平對(duì)山羊瘤胃上皮生長(zhǎng)的影響，并研究了高能量日糧通過IGF系統(tǒng)促進(jìn)瘤胃上皮生長(zhǎng)的細(xì)胞和分子生物學(xué)機(jī)理。
　　 1.日糧能量水平對(duì)山羊瘤胃上皮生長(zhǎng)的影響
　　 選取18只青年波雜山羊(波爾山羊×淮南羊雜交山羊，120 d，BW14.27

2、±0.69 kg)隨機(jī)分成高能量組(HL，n=9，ME:1.00 MJ/(kg0.75·d))和低能量組(LL，n=9，ME:0.60MJ/(kg0.75·d))，飼喂42 d后處死山羊，采集瘤胃上皮樣品。游標(biāo)卡尺測(cè)量、計(jì)算瘤胃乳頭表面積;組織切片法觀察瘤胃上皮組織形態(tài);生化分析技術(shù)測(cè)定上皮蛋白、DNA和RNA含量;流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期;Real-time Q-PCR法測(cè)定瘤胃上皮cyclin D1、CDK4、IGF-1R、IGFBP

3、-3 mRNA表達(dá);Western Blot方法測(cè)定cyclin D1、CDK4蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果顯示:
　　 1)與LL組相比，HL組山羊日增重、瘤胃干重、瘤胃上皮乳頭長(zhǎng)度和表面積顯著增大(P＜0.05)，表明高能量日糧顯著促進(jìn)瘤胃上皮乳頭生長(zhǎng)。
　　 2)組織切片和蛋白:DNA比率的測(cè)定觀察到HL組棘突層和顆粒層細(xì)胞層數(shù)增多（P＜0.05），體積減小(P＜0.05），提示高能量日糧促進(jìn)瘤胃乳頭生長(zhǎng)主要通過

4、加速細(xì)胞增殖，而非細(xì)胞肥大。
　　 3)流式細(xì)胞術(shù)分析表明HL組G1期(DNA合成前期)細(xì)胞比率降低（P＜0.05），而S期(DNA合成期)和G2/M期（有絲分裂期）細(xì)胞比率升高(P＜0.05)，其結(jié)果可能加速細(xì)胞周期G1期進(jìn)程，推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期和G2/M期，進(jìn)而促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞增殖。
　　 4)HL組瘤胃上皮G1期細(xì)胞周期蛋白cyclin D1的mRNA表達(dá)提高32％(P＜0.05)，蛋白質(zhì)表達(dá)增加48％(P＜

5、0.05)，其激酶CDK4的蛋白表達(dá)增加18％(P＜0.05)，提示高能量日糧條件下山羊瘤胃上皮細(xì)胞細(xì)胞周期G1期進(jìn)程加快與G1期細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和其激酶CDK4表達(dá)升高有關(guān)。
　　 以上體內(nèi)研究表明高能量日糧提高山羊瘤胃上皮cyclin D1蛋白表達(dá)，加速細(xì)胞周期G1期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖，加快瘤胃乳頭生長(zhǎng)。
　　 2.日糧能量水平影響山羊瘤胃上皮生長(zhǎng)的機(jī)理研究
　　 采用了體內(nèi)研究和體外研究的方法

6、研究日糧能量水平影響山羊瘤胃上皮生長(zhǎng)的機(jī)理。動(dòng)物試驗(yàn)及樣品采集方法同系列一，實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)第14d、第35 d分別于第一次采食前1h頸靜脈采血。放射性免疫分析法測(cè)定血清IGF-1濃度;Western blot方法測(cè)定瘤胃上皮ERK、pERK、AKT和pAKT蛋白表達(dá)，得到日糧能量水平對(duì)IGF-1受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響。
　　 體內(nèi)試驗(yàn)研究結(jié)果顯示:
　　 1)HL組山羊血清IGF-1濃度在所測(cè)各時(shí)間點(diǎn)均高于LL組（P＜0

7、.05），提示高能量促進(jìn)瘤胃上皮乳頭生長(zhǎng)可能和血清IGF-1升高有關(guān)。
　　 2)HL組山羊瘤胃上皮pERK/ERK比率顯著高于LL組（P＜0.05），提示高能量日糧促進(jìn)山羊瘤胃上皮ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化;體內(nèi)試驗(yàn)中未能檢測(cè)到pAKT蛋白表達(dá)。
　　 體外試驗(yàn)選取4只健康青年波雜交山羊，屠宰采集瘤胃上皮樣品，胰蛋白酶消化獲得單個(gè)瘤胃細(xì)胞后進(jìn)行原代培養(yǎng)，24 h細(xì)胞附著后，分別加入IGF-1、專一性IGF-1R抑制劑(PP

8、P)、ERK抑制劑、AKT抑制劑處理，繼續(xù)培養(yǎng)8h或24 h后收集細(xì)胞檢測(cè)。3H-TdR摻入法測(cè)定細(xì)胞DNA合成，Real-time Q-PCR法測(cè)定cyclin D1和CDK4mRNA表達(dá);Western blot方法測(cè)定cyclin D1、CDK4、ERK、pERK、AKT和pAKT蛋白表達(dá)。
　　 體外試驗(yàn)研究結(jié)果顯示:
　　 3) IGF-1(25μg/L)顯著提高體外培養(yǎng)瘤胃上皮細(xì)胞3H-TdR摻入率，較對(duì)照組

9、提高44％(P＜0.05)，IGF-1+IGF-1R抑制劑(PPP)組較IGF-1組降低了30％(P＜0.05)，提示IGF-1必須與IGF-1R才能促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞增殖。
　　 4) IGF-1顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)瘤胃上皮細(xì)胞G1期cyclin D1 mRNA(P＜0.05)和蛋白（P＜0.05）表達(dá)，而對(duì)其激酶CDK4 mRNA和蛋白表達(dá)無顯著影響，且IGF-1R抑制劑抑制IGF-1對(duì)cylin D1蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用（P＜0.

10、05）。提示IGF通過提高cyclin D1表達(dá)，增加G1期cyclin D1-CDK4復(fù)合物合成。
　　 5)IGF-1顯著增大瘤胃上皮細(xì)胞pERK/ERK比率（P＜0.05）;且ERK抑制劑顯著抑制IGF-1對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞cyclin D1蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用（P＜0.05）;而體外IGF-1(P＞0.05)和ERK抑制劑（P＞0.05）對(duì)細(xì)胞CDK4蛋白表達(dá)均無顯著影響。
　　 6)體外試驗(yàn)中亦未能檢測(cè)到pAKT蛋白

11、表達(dá)，而AKT抑制劑顯著抑制IGF-1對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞cyclinD1蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用（P＜0.05），提示PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能在體外試驗(yàn)中起作用，其機(jī)制目前尚不明了。
　　 對(duì)體內(nèi)、外試驗(yàn)結(jié)果的綜合分析可以看出:高能量日糧通過提高山羊IGF-1血清濃度促進(jìn)瘤胃上皮cyclin D1蛋白合成并增加cyclin D1-CDK4復(fù)合物，從而加速細(xì)胞周期G1期進(jìn)程，進(jìn)而促進(jìn)瘤胃上皮乳頭增殖。高能量日糧引起山羊血漿IGF-1