飼喂高精料日糧對(duì)泌乳奶山羊瘤胃發(fā)酵和上皮組織炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、反芻動(dòng)物瘤胃擁有數(shù)量巨大且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的微生物系統(tǒng)，是物質(zhì)代謝的的主要場(chǎng)所。為了滿足泌乳反芻動(dòng)物的高泌乳性能，常飼喂含精料較高的日糧，但往往會(huì)引發(fā)反芻動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激。在應(yīng)激激素皮質(zhì)醇升高的基礎(chǔ)上，本文探索了長(zhǎng)期或短期飼喂高精料日糧對(duì)瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)、代謝產(chǎn)物的影響及瘤胃上皮相關(guān)基因的表達(dá)變化并研究了不同濃度人工合成皮質(zhì)激素——地塞米松對(duì)體外培養(yǎng)瘤胃微生物發(fā)酵的影響。
　　1長(zhǎng)期或短期飼喂高精料日糧對(duì)瘤胃細(xì)菌菌群的結(jié)構(gòu)、代謝產(chǎn)物及瘤胃相

2、關(guān)基因表達(dá)的影響
　　試驗(yàn)選用泌乳期關(guān)中奶山羊15只，體重與泌乳量相近，隨機(jī)分為低精料日糧對(duì)照組（精粗比35∶65）和高精料組（精粗比65∶35）。飼喂15周后，將對(duì)照組羊分為2組，一組繼續(xù)飼喂低精料日糧（精粗比35∶65，LC，n=5），另一組飼喂高精料日糧，飼喂期4周作為高精料日糧短期飼喂組（精粗比65∶35，HS，n=5），高精料日糧長(zhǎng)期組飼喂期為19周（精粗比65∶35，HL，n=5）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采集瘤胃液、血液和瘤胃上皮

3、組織等樣品。提取瘤胃液微生物基因組DNA，對(duì)細(xì)菌V3-V4區(qū)域進(jìn)行454焦磷酸測(cè)序，并用絕對(duì)定量real-time PCR方法檢測(cè)瘤胃液中細(xì)菌(Bacteria)、原蟲(chóng)(Ciliate)、產(chǎn)甲烷菌(Methanogens)及真菌(Anaerobic fungi)的含量;對(duì)瘤胃液樣品進(jìn)行GC-MS代謝組學(xué)檢測(cè);氣相色譜法檢測(cè)揮發(fā)性脂肪酸含量;采用放射免疫分析(Radioimmunoassay, RIA)法檢測(cè)血液中的激素水平;采用經(jīng)典的生

4、化分析法測(cè)定血漿中組胺(Histamine)、瘤胃液中乳酸(Lactic acid)、微生物蛋白(Microbial crudeprotein，MCP)及氨態(tài)氮(Ammonia nitrogen，NH3-N)的含量;Real-time PCR法檢測(cè)瘤胃上皮組織中炎癥、VFA轉(zhuǎn)運(yùn)載體及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。
　　結(jié)果顯示:與LC對(duì)照組比較，HS組山羊靜脈血中皮質(zhì)醇濃度無(wú)顯著變化(P＞0.05)，但長(zhǎng)期飼喂高精料導(dǎo)致循環(huán)血中皮質(zhì)醇濃度顯

5、著低于對(duì)照組和短期組(P＜0.05)。HL組山羊血液中組胺濃度顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，但短期組未出現(xiàn)明顯變化(P＞0.05)。飼喂高精料日糧對(duì)瘤胃液中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量無(wú)顯著影響，但與對(duì)照組相比，HL組乙酸/丙酸比例顯著降低(P＜0.05)，而乳酸含量顯著升高(P＜0.05)，HS組和HL組瘤胃液中NH3-N、 MCP和LPS含量均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，但HS組和HL組之間無(wú)顯著

6、性差異(P＞0.05)。代謝組學(xué)分析瘤胃液成分表明，LC、HS、HL三組兩兩之間代謝產(chǎn)物存在明顯差異(P＜0.05)。
　　與對(duì)照LC組相比，短期HS組與長(zhǎng)期HL組的細(xì)菌菌群豐度指數(shù)(Chao1和ACE)和細(xì)菌菌群多樣性指數(shù)(Shannon)都顯著降低(P＜0.05)。采食高精料時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)大部分門(mén)類(lèi)細(xì)菌的相對(duì)比例無(wú)顯著影響，但與對(duì)照組相比，短期飼喂高精料顯著下降了Cyanobacteria的相對(duì)比例(P＜0.05)，長(zhǎng)期組Ver

7、mcomicrobia相對(duì)比例顯著低于短期組(P＜0.05)。高通量主成分分析表明，高精料飼喂對(duì)屬水平瘤胃細(xì)菌菌群組成有較大影響，但長(zhǎng)期組與短期組在屬水平上的差異不顯著(p＞0.05）。
　　飼喂高精料持續(xù)時(shí)間對(duì)瘤胃上皮組織炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響:(1)與對(duì)照LC組相比，短期HS組與長(zhǎng)期HL組TLR4 mRNA表達(dá)量顯著升高(P＜0.05)，IL-8 mRNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，HS組MyD88 mRNA表達(dá)量

8、明顯下降(P＜0.05)，HL組IL-10 mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05）。然而，飼喂高精料對(duì)瘤胃上皮組織中TNF-α、TLR2、INF-γ、 IL-1α mRNA的表達(dá)量無(wú)顯著影響(P＞0.05)。(2)飼喂高精料對(duì)瘤胃VFA轉(zhuǎn)運(yùn)載體相關(guān)基因表達(dá)的影響，與LC相比，HS組和HL組瘤胃上皮組織中NHE2和NEH3 mRNA表達(dá)量都顯著的升高(P＜0.05)，但HS和HL組之間無(wú)顯著差異(P＞0.05)，這與Na/K ATPase

9、 mRNA表達(dá)量結(jié)果一致;但對(duì)MCT1和MCT4 mRNA表達(dá)量無(wú)明顯影響(P＞0.05)。(3)飼喂高精料對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響，HS和HL組瘤胃上皮中Caspase-3、Caspase-8 mRNA表達(dá)量較對(duì)照組顯著上調(diào)(P＜0.05），HL組瘤胃上皮組織中Bax基因表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)。與LC組相比，HS組Caspase-3活性顯著升高(P＜0.05），但長(zhǎng)期飼喂高精料未對(duì)其活性產(chǎn)生影響(P＞0.05）。

10、r>　　以上結(jié)果提示:長(zhǎng)期和短期飼喂高精料日糧顯著降低瘤胃液中細(xì)菌多樣性、改變瘤胃微生物組成及瘤胃微生物的發(fā)酵類(lèi)型、增加瘤胃內(nèi)有害代謝產(chǎn)物;并引起瘤胃上皮細(xì)胞應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，且長(zhǎng)期飼喂高精料日糧較短期飼喂的影響更為明顯。
　　2地塞米松對(duì)體外培養(yǎng)瘤胃微生物發(fā)酵功能的影響
　　采用瘤胃液體外人工發(fā)酵模型，研究化學(xué)合成的糖皮質(zhì)激素——地塞米松對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵的影響，以探索瘤胃液中皮質(zhì)醇濃度升高對(duì)其發(fā)酵功能的調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照

11、組(CON)、乙醇溶劑組(ETH)、低濃度地塞米松組(1 ng/mL，LD)、中濃度地塞米松組(5 ng/mL，MD)和高濃度地塞米松組(10 ng/mL，HD)，每組3個(gè)重復(fù)。用精粗比40∶60的日糧作為培養(yǎng)底物，連續(xù)培養(yǎng)24 h。分別在0、2、4、8、12和24 h采集培養(yǎng)液測(cè)定pH值;氣相色譜法檢測(cè)揮發(fā)性脂肪酸含量;生化分析法測(cè)定瘤胃液中乳酸(Lactic acid)、微生物蛋白(Microbial crude protein，M

12、CP)及氨態(tài)氮(Ammonia nitrogen，NH3-N)的含量;絕對(duì)定量PCR的方法檢測(cè)瘤胃中部分細(xì)菌豐富度。
　　結(jié)果顯示:地塞米松和發(fā)酵時(shí)間顯著影響瘤胃液pH，且兩因素間存在顯著互作效應(yīng)(P＜0.01)。12h時(shí)HD組pH極顯著低于CON組(P＜0.01)，顯著低于ETH組(P＜0.05)。24 h時(shí)，HD組的pH低于6.0，且極顯著低于CON組和ETH組(P＜0.01)。地塞米松和發(fā)酵時(shí)間極顯著升高瘤胃液中總揮發(fā)性脂肪

13、酸的濃度(P＜0.01)，但二者無(wú)交互效應(yīng)。HD組于發(fā)酵24 h時(shí)總揮發(fā)性脂肪酸顯著高于CON組(P＜0.05)。地塞米松和發(fā)酵時(shí)間極顯著升高乙酸的濃度，且存在極顯著的互作效應(yīng)(P＜0.01)。24 h時(shí)乙酸濃度顯著或極顯著高于對(duì)照組和低劑量地塞米松處理組(P＜0.05或P＜0.01)，而丁酸含量則低于CON與ETH組，丙酸濃度與其他組無(wú)顯著差異。地塞米松和發(fā)酵時(shí)間極顯著影響瘤胃液中乳酸濃度(P＜0.01)，但二者無(wú)交互效應(yīng)。隨發(fā)酵時(shí)間

14、的延長(zhǎng)，CON、ETH、LD和MD組的乳酸濃度均先升高后降低，HD組則逐漸下降。
　　NH3-N濃度僅受發(fā)酵時(shí)間的影響，而地塞米松對(duì)其無(wú)顯著影響。發(fā)酵期間各組NH3-N濃度均逐漸升高，且培養(yǎng)后期(12～24 h)每組之間濃度差異不明顯。地塞米松、發(fā)酵時(shí)間和二者綜合效應(yīng)均極顯著影響瘤胃液MCP的濃度(P＜0.01)。MCP呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后下降的變化，培養(yǎng)后期(12～24 h)各組MCP量大幅度下降，24 h時(shí)各組之間無(wú)明顯變化。