GABRP對水牛乳腺上皮細胞增殖以及泌乳相關(guān)基因表達的影響.pdf

1、γ-氨基丁酸是大腦中抑制性遞質(zhì)的一種重要成分，在神經(jīng)信號傳遞中起著重要作用。除腦組織外，γ-氨基丁酸及其受體還存在于多種外周組織中。γ-氨基丁酸的受體有A、B、C三種類型，其中A、C屬于門控Cl-通道，B型受體是代謝型受體，屬于G蛋白偶聯(lián)家族。π亞基(GABRP)是發(fā)現(xiàn)的一種新型的A型受體亞基。目前對GABRP在癌組織中研究較多，發(fā)現(xiàn)它能調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖和遷移，但有關(guān)其在外周內(nèi)分泌組織中的作用研究較少。在乳腺組織中，GABRP主要與乳

2、腺癌細胞的遷移有關(guān)，幾乎沒有與乳腺上皮細胞增殖分化方面的研究。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，GABRP基因是Stat5a下游的一個靶基因，GABRP基因的表達在小鼠妊娠后期顯著升高，推測π亞基在乳腺發(fā)育以及泌乳方面發(fā)揮著重要的作用。本課題通過研究GABRP基因?qū)λＨ橄偕掀ぜ毎鲋骋约懊谌橄嚓P(guān)基因表達的影響，在細胞水平上初步了解π亞基的功能，研究結(jié)果為進一步了解水牛乳腺細胞的生長規(guī)律及泌乳機制奠定基礎(chǔ)。
　　1.水牛GABRP基因的克隆及其

3、在乳腺組織中的表達分析。以GenBank數(shù)據(jù)庫中牛的GABRP(NM_001015618.1)為參考序列設(shè)計合成特異性擴增引物，以水牛乳腺組織總RNA為模板，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴增水牛GABRP基因的cDNA序列，結(jié)果顯示，獲得的片段與河流型水牛GABRP基因序列的同源性為99.4％，說明克隆得到了水牛的GABRP基因;應(yīng)用QRT-PCR技術(shù)檢測不同時期水牛乳腺組織GABRP基因的表達，結(jié)果顯示，GABRP基因在泌乳期和非泌乳期乳腺組

4、織中都有表達，且非泌乳期的表達量要顯著高于泌乳期(P＜0.05);應(yīng)用免疫組化技術(shù)對GABRP蛋白在泌乳期水牛乳腺組織進行定位分析，結(jié)果顯示，GABRP蛋白主要在乳腺組織的腺泡上皮中表達。
　　2.水牛乳腺上皮細胞的分離純化鑒定。從屠宰場取回新鮮的泌乳期水牛乳腺組織，利用組織塊貼壁法和胰蛋白酶消化差異法分離純化水牛乳腺上皮細胞，并用免疫熒光染色技術(shù)鑒定乳腺上皮細胞特異性骨架蛋白—角蛋白18。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，組織塊貼壁法可分離得到乳腺上皮

5、細胞，純化的乳腺上皮細胞表達角蛋白18，并且具有正常的增殖能力。
　　3.不同濃度GABA、GABAA受體激動劑muscimol處理對水牛乳腺上皮增殖和泌乳相關(guān)基因表達的影響。在水牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)液中分別加入50μm/L、100μm/L、500μm/L的GABA，0.5μm/L、5μm/L、50μm/L的muscimol，CCK8試劑盒檢測乳腺上皮細胞的增殖情況;流式細胞儀檢測不同濃度GABA和muscimol處理對水牛乳腺上皮

6、細胞周期的影響對水牛乳腺上皮細胞周期的影響;QRT-PCR技術(shù)檢測添加GABA和muscimol對細胞周期蛋白CyclinD1、GABRP以及mTOR、FABP3、GLUT等泌乳相關(guān)基因表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GABA、muscimol能顯著抑制水牛乳腺上皮細胞的增殖(P＜0.05)，且抑制效率與GABA、muscimol的濃度及處理時間有關(guān)。不同濃度的GABA和muscimol處理均能增加G1期細胞比例，降低S、G2期細胞的比例;不同濃